采用帶質(zhì)譜功能的ACQUITY Arc系統(tǒng)對(duì)果汁等飲料中的單糖、雙糖及指定糖醇進(jìn)行分析和定量

Mark E. Benvenuti, Gareth Cleland和Jennifer Burgess

沃特世公司(美國(guó)馬薩諸塞州米爾福德)

關(guān)鍵詞

糖，糖類，果糖，葡萄糖，蔗糖，麥芽糖，甘露糖醇，山梨糖醇，威士忌，碳水化合物

應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

■ 與示差折光(RI)檢測(cè)器或蒸發(fā)光散射(ELS)檢測(cè)器相比，可檢測(cè)濃度更低的糖類。
■ 樣品前處理要求極少，還可稀釋樣品以降低基質(zhì)效應(yīng)。
■ 可實(shí)現(xiàn)難分離異構(gòu)體對(duì)山梨糖醇和甘露糖醇的色譜分離。

沃特世解決方案

ACQUITY^® Arc™系統(tǒng)
ACQUITY QDa^®質(zhì)譜檢測(cè)器
XBridge^® BEH Amide XP色譜柱
Empower^® 3 CDS軟件

簡(jiǎn)介

糖類和糖醇類物質(zhì)都屬于碳水化合物，對(duì)于人類而言是非常重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是食物中的天然成分。隨著發(fā)達(dá)國(guó)家的肥胖癥和糖尿病患病率日益上升，近年來(lái)人們對(duì)于監(jiān)控糖類攝入量的關(guān)注也急劇增加。因此，要滿足日益嚴(yán)格的法規(guī)要求，食品標(biāo)簽提供的信息必須準(zhǔn)確無(wú)

誤。分析產(chǎn)品中糖類的含量也是辨別產(chǎn)品真?zhèn)魏妥R(shí)別摻假行為的有用的工具。

由于缺乏發(fā)色團(tuán)且分子之間非常相似，糖類和糖醇類的分析一直以來(lái)都是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的應(yīng)用。許多糖類化合物彼此互為異構(gòu)體，圖1展示了本研究所分析的化合物的分子式和結(jié)構(gòu)。HPLC憑借其分離能力、準(zhǔn)確度和分析速度方面的優(yōu)勢(shì)，成為了糖類分析的首選方法。RI 和ELS檢測(cè)的替代方法是電噴霧離子(ESI)質(zhì)譜檢測(cè)。質(zhì)譜檢測(cè)是對(duì)傳統(tǒng)LC 檢測(cè)器的補(bǔ)充。

 

圖1. 本研究所分析的糖類化合物的結(jié)構(gòu)和分子式。

實(shí)驗(yàn)

LC條件

LC 系統(tǒng)： ACQUITY Arc
數(shù)據(jù)系統(tǒng)： Empower 3
運(yùn)行時(shí)間： 40.0 min
色譜柱： XBridge^® XP BEH Amide 2.5 µm, 3.0 x 150 mm
柱溫： 85 °C
流動(dòng)相A ： 90%乙腈:5% 異丙醇:5% 水*
流動(dòng)相B ： 80%乙腈:20%水*
流速： 0.8 mL/min
進(jìn)樣體積： 1 µL

MS條件

MS系統(tǒng)： ACQUITY QDa (Performance 版本)
電離模式： ESI-
毛細(xì)管電壓： 0.8 V
錐孔電壓： 5.0 V
探頭溫度： 600 °C
采集速率： 2 Hz
全掃描： 50~800 Hz
曲線擬合： 二次曲線，1/x加權(quán)
平滑： 均值過(guò)濾器，7 級(jí)

標(biāo)準(zhǔn)品制備

使用乙腈-水(1:1)制備含上述9種糖類的儲(chǔ)備溶液，濃度為100 mg/L。 將該儲(chǔ)備溶液進(jìn)一步稀釋為9個(gè)不同的濃度(1、2、4、5、10、20、40、50和100 mg/L)。

樣品前處理

所有樣品均購(gòu)自當(dāng)?shù)�。所分析的果汁樣品包括橙汁、蘋果汁、菠蘿汁、石榴汁和葡萄汁。所分析的酒精性飲料包5種啤酒、3種窖藏啤酒(其中1種不含酒精)、1種檸檬風(fēng)味啤酒、1種烈性蘋果酒、1種雪利酒、1種紅葡萄酒和4種威士忌。啤酒樣品經(jīng)超聲處理去碳酸化。所有樣品均采用0.22 µm PVDF注射式過(guò)濾器過(guò)濾，并使用乙腈-水(1:1)稀釋。稀釋因子列于表1中。

表1. 所研究的“現(xiàn)成”樣品的稀釋因子。

在本研究中，我們有機(jī)會(huì)在降低檢測(cè)限的同時(shí)獲得樣品中各成分的質(zhì)譜信息。色譜保留時(shí)間與質(zhì)量信息的結(jié)合能夠提升糖類和糖醇分析的選擇性。在這里，我們展示了將Waters^®  ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測(cè)器與ACQUITY Arc系統(tǒng)聯(lián)用，對(duì)果汁、葡萄酒、啤酒和威士忌樣品中的糖類進(jìn)行分析和定量的應(yīng)用。

結(jié)果與討論

圖2展示了配備有ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測(cè)器和PDA檢測(cè)器的ACQUITY Arc系統(tǒng)。圖中展示的PDA僅供參考，本應(yīng)用并未使用。圖3為100 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)品的SIR色譜圖，圖中分別標(biāo)出了上述9種分析物。所有標(biāo)準(zhǔn)品的分離結(jié)果都非常出色。首先使用等度條件分離質(zhì)量較小的糖類，其中包括難分離異構(gòu)體對(duì)山梨糖醇和甘露糖醇。4.5分鐘后啟用梯度，及時(shí)分離混合物中分子量較大的糖類。

圖2. 配備了PDA 和ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測(cè)器的ACQUITY Arc系統(tǒng)。

圖3. 本研究所用的9種糖類標(biāo)準(zhǔn)品的SIR色譜圖。標(biāo)注的m/z代表[M+Cl]-加合物的m/z。

圖4 展示了從各標(biāo)準(zhǔn)品的SIR中提取的質(zhì)譜圖。流動(dòng)相中添加了鹽酸胍，可確保化合物形成氯加合物([M+Cl]-離子)。圖中還顯示了較弱的³⁷Cl加合物響應(yīng)。圖5展示了所研究化合物的校準(zhǔn)曲線。所有分析物的R2值均大于0.995。

圖4. 從9種糖類標(biāo)準(zhǔn)品的SIR中提取的質(zhì)譜信息。標(biāo)注的m/z代表[M+Cl]-加合物的m/z。

圖5. 所分析的9種糖類標(biāo)準(zhǔn)品的校準(zhǔn)曲線，同時(shí)顯示了每種分析物的R2值。

圖6(A–E)展示了窖藏啤酒的SIR分析結(jié)果。圖6A(m/z 185)中出現(xiàn)了阿拉伯糖，但還存在其它峰，這表明樣品中含有其它戊糖。在圖6B(m/z215)中可以看到果糖和葡萄糖。與靈敏度較低的方法(如示差折光法)相比，ACQUITY QDa的高靈敏度改善了這些化合物的檢測(cè)結(jié)果¹。在圖6C(m/z217)中可以看到山梨糖醇和甘露糖醇。我們還可以看到代表提取到的果糖和葡萄糖Cl²加合物的小峰，它們與山梨糖醇和甘露糖醇具有相同的分子量。在圖5D和5E (m/z分別為377和539)中，我們可以觀察到麥芽糖和鼠李糖的DP2和DP3化合物，以及相同質(zhì)量的異構(gòu)體(可能出現(xiàn)在由谷物制成的飲料中)。

圖6. 帶標(biāo)注的窖藏啤酒SIR分析結(jié)果，圖中標(biāo)注有樣品中檢測(cè)到的糖類。

圖7(A–E)展示了雪利酒的分析結(jié)果。在雪利酒中檢測(cè)到的主要分析物為果糖和葡萄糖(圖7B)。此外還有少量的阿拉伯糖(圖7A)以及痕量的山梨糖醇和甘露糖醇(圖7C)，還可以明確檢測(cè)到麥芽糖(圖7D)。如我們所預(yù)期，樣品中不存在DP3化合物(圖7E)，因?yàn)檠├�酒的主要原料是葡萄而非谷類�?/p>

 圖7. 雪利酒的SIR分析結(jié)果，圖中標(biāo)注有樣品中檢測(cè)到的糖類。

圖8(A–E)展示了威士忌樣品的SIR分析結(jié)果。樣品中存在阿拉伯糖(圖8A)，還可以明確檢測(cè)到果糖和葡萄糖(圖8B)。特別值得注意的是，在圖8B(m/z 215)和8C(m/z 217)中，保留時(shí)間4.85分鐘處均出現(xiàn)了一種未知的糖類。如果僅參考RI和ELS檢測(cè)器得到的保留時(shí)間，該峰很可能被誤鑒定為甘露糖醇。m/z 215和m/z 217處均出現(xiàn)了該峰，表明該化合物具有與單糖(而非糖醇)相同的質(zhì)量，而且甘露糖醇不產(chǎn)生m/z 215的離子(如圖2和3所示)。

最后，圖9(A–E)展示了蘋果汁樣品的SIR色譜圖。圖中突顯了樣品中存在的阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、山梨糖醇和蔗糖。

各種果汁的定量結(jié)果如表2所示。橙汁、蘋果汁和菠蘿汁中含有果糖、葡萄糖和蔗糖。這些果汁中糖類的含量和比例與其它報(bào)道的數(shù)據(jù)類似^2,3。值得注意的是，我們?cè)谑�榴汁中檢測(cè)到了山梨糖醇。山梨糖醇一般不會(huì)出現(xiàn)在石榴汁中⁴，因此該檢測(cè)結(jié)果表明樣品可能摻假。測(cè)試第二個(gè)樣品時(shí)未檢測(cè)到山梨糖醇(圖10)。在葡萄汁樣品中檢測(cè)到了果糖和葡萄糖，但沒(méi)有檢測(cè)到預(yù)期應(yīng)該存在蔗糖^2,3。

圖8. 威士忌的SIR分析結(jié)果，圖中標(biāo)注有樣品中檢測(cè)到的糖類以及在m/z 215處檢測(cè)到的未知糖類。

圖9. 蘋果汁樣品的SIR分析結(jié)果，圖中標(biāo)注有樣品中檢測(cè)到的糖類。

表2. 在本研究中，對(duì)各種果汁進(jìn)行定量研究時(shí)計(jì)算所得的濃度(g/L) 。

圖10. 放大的SIR色譜圖，圖中標(biāo)注有在兩個(gè)石榴汁樣品中檢測(cè)到的糖類。其中一個(gè)樣品中檢測(cè)到了山梨糖醇，表明該樣品可能是摻假樣品。

表3. 基于橙汁樣品的7次進(jìn)樣所得的保留時(shí)間(min)和濃度(g/L) 重現(xiàn)性數(shù)據(jù)。

結(jié)論

■  ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測(cè)器與ACQUITY Arc系統(tǒng)聯(lián)用可提升分析的靈敏度和選擇性，讓分析人員通過(guò)一次進(jìn)樣即可同時(shí)對(duì)單糖和雙糖進(jìn)行分析和定量。
■  質(zhì)譜檢測(cè)是示差折光(RI)或蒸發(fā)光散射(ELS)方法的有效替代方法。
■  該方法的高靈敏度使得分析可以采用更高的稀釋水平，從而實(shí)現(xiàn)了基質(zhì)效應(yīng)最小化。
■  質(zhì)譜檢測(cè)與色譜分離的結(jié)合提高了鑒定目標(biāo)分析物的選擇性，同時(shí)減少了假陽(yáng)性結(jié)果。

參考文獻(xiàn)

1.M Castellari et al. Determination of Carboxylic Acids, Carbohydrates,Glycerol, Ethanol,   and 5-HMF in Beer by High-Performance Liquid Chromatograghy and UV-Refractive Index  Double Detection. Journal of Chromatographic Science. 39: 236-238, January 2001. 2.M L Sanz et al. Inositols and carbohydrates in different fresh fruit juices. Food Chemistry.  87: 325-328, 2004. 3.M Benvenuti. Analysis of Food Sugars in Various Matrices. Waters application note  no.  720004677EN, May, 2013.                                                                                                           4. R Jahromi. 6.21 Reference Guide for Pomegranate. Revision June 2012.

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