芎歸湯有效組分抗東莨菪堿致癡呆模型學(xué)習(xí)記憶能力減退量-效關(guān)系研究

水迷宮和跳臺實(shí)驗(yàn)相關(guān)文獻(xiàn)：芎歸湯有效組分抗東莨菪堿致癡呆模型學(xué)習(xí)記憶能力減退量-效關(guān)系研究

摘 要 目的：對芎歸湯有效組分抗東莨菪堿致癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退的改善作用進(jìn)行藥效評價，并確定芎歸湯有效組分對抗癡呆模型改善學(xué)習(xí)記憶藥理學(xué)效應(yīng)的" 量-效" 關(guān)系和 ED50，為進(jìn)一步開展藥效評價提供劑量依據(jù)。方法：取昆明種小鼠進(jìn)行Morris 水迷宮、跳臺篩選訓(xùn)練，將合格的小鼠 80 只，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為正常對照組、東莨菪堿致癡呆模型組、藥效劑量 1 ～ 5 組和陽性藥組，實(shí)驗(yàn)前分別給予各自治療藥物，連續(xù)給藥 30 天后，除正常對照組外均腹腔注射東莨菪堿造模，30 min 后進(jìn)行Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)及跳臺實(shí)驗(yàn)，分析比較不同劑量組之間學(xué)習(xí)記憶能力差異性。結(jié)果：小鼠 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，芎歸湯有效組分對東莨菪堿致癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退有明顯改善作用，可以明顯縮短小鼠水迷宮潛伏期，在 10． 92 ～ 43． 68 g/kg 劑量范圍內(nèi)均有顯著性差異，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其 ED50為 4． 79g/kg。小鼠跳臺實(shí)驗(yàn)顯示，芎歸湯有效組分對東莨菪堿致癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退有明顯改善作用，可以延長小鼠跳臺潛伏期和減少跳臺錯誤次數(shù)，在 2． 73 ～ 43． 68 g/kg 劑量范圍內(nèi)均有顯著性差異，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其 ED50為 2． 70g/kg。結(jié)論：芎歸湯有效組分對東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退有明顯的改善作用，并且隨著劑量的增加藥效越來越明顯，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，具有明顯的" 量-效" 關(guān)系。

關(guān)鍵詞 芎歸湯有效組分; 東莨菪堿癡呆小鼠; Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn); 跳臺實(shí)驗(yàn); 學(xué)習(xí)記憶能力; " 量-效" 關(guān)系

阿爾茨海默病( Alzheimer disease，AD) 又稱老年性癡呆，是嚴(yán)重威脅著老年人群的身心健康與生命安全的重大疾病�，F(xiàn)代研究證實(shí)，阿爾茨海默病是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，伴有認(rèn)知及行為障礙，其發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，涉及多系統(tǒng)、多環(huán)節(jié)的異常。由于其起病隱匿、病因不明、治療時間長、治療和護(hù)理費(fèi)用昂貴等原因，己成為世界上繼心臟病、腫瘤和中風(fēng)之后的第 4 位死亡原因。因此，衰老及抗癡呆藥物的研究已成為老年醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)，越來越受到人們的關(guān)注。芎歸湯是本實(shí)驗(yàn)研制的，由川芎、當(dāng)歸、淫羊藿組成的具有行氣活血、溫腎強(qiáng)志之功效的中藥復(fù)方制劑，但是由于中藥本身成分復(fù)雜，作用多樣的藥效學(xué)特點(diǎn)，其對不同病因病機(jī)引起的癡呆病癥藥效學(xué)關(guān)系研究較少，因此有必要在經(jīng)典的東莨菪堿致癡呆模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用 Morris 水迷宮和跳臺實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行藥效學(xué)相關(guān)性研究，研究結(jié)果如下:

1 材料

1.1 試驗(yàn)藥物 川芎、當(dāng)歸、淫羊藿，分別按照 2010 版中國藥典，經(jīng)國家中藥創(chuàng)制項(xiàng)目組鑒定為傘形科植物川芎( LigusticumChuanxiong Hort．) 的干燥根莖，批號 20110312; 傘形科植物當(dāng)歸( Angelia Sinessis( oliv．) Diels) 的干燥根，批號 20110305; 小檗科植物淫羊藿( Epimedium brevicornu Maxim) 的干燥葉，批號20100328。均由安徽世貿(mào)醫(yī)藥有限公司提供。芎歸湯由川芎、當(dāng)歸、淫羊藿按照 4: 2: 1 組成( 川芎 24 g，當(dāng)歸 12g，淫羊藿 6 g，70 kg 人每日用量為 42 g。稱取川芎、當(dāng)歸適量，適當(dāng)粉碎后，置于 3000 ml 圓底燒瓶中，加入 12 倍量水浸泡 3h，于電熱套中加熱冷凝回流至揮發(fā)油不再增加，收集揮發(fā)油，記錄體積( ml) 。藥液于 4 層紗布過濾，收集水提液，濃縮。濾渣加處方比例的淫羊藿適量，置于 3000 ml 圓底燒瓶中，分別加入10 倍、8 量70% 乙醇加熱冷凝回流 2 h 和 1.5 h，6 層紗布過濾，合并兩次醇提液，回收乙醇后濃縮。醇提濃縮浸膏與水提濃縮浸膏混合，再將揮發(fā)油與吐溫以 1: 1 比例研磨混勻，加入混合濃縮液中得最終芎歸湯工藝一藥物浸膏，得率: 39． 70%，批號: 2011040101。結(jié)合原處方人用量、藥學(xué)各部分提取率和藥效預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，按人日用量以體表面積折算小鼠劑量的 8、4、2、1、0.5 倍為給藥劑量，劑量大小為 43.68 g/kg、21.84 g/kg、10.92 g/kg、5.46g / kg、2.7 g / kg，按等體積不同濃度原則配置，各組灌胃體積均按 25 ml/kg 計算。鹽酸多奈哌齊分散片，規(guī)格: 每片含鹽酸多奈哌齊 5 mg，山東羅欣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號: 091243，按人日用量以體表面積折算小鼠劑量的 2 倍為給藥劑量，劑量大小為 1.3mg/kg，按 25 ml / kg 體積灌胃。

1.2 動物 昆明種小鼠，SPF 極，體重 18.0 ～ 22.0g，雌雄各半，SPF 級，由山東大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號: SCXK ( 魯)20090001。給予 SPF 級普通小鼠飼料飼養(yǎng)( 山東大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動物配合飼料( 鼠) ，生產(chǎn)許可證號: SCXK( 魯)20090014) 。

1.3 試劑 東莨菪堿氫溴酸鹽，純度 ≥ 99.0% ，蘇州工業(yè)園區(qū)亞科化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號: YK2011031201。臨用時用蒸餾水配置成 2 mg/kg 濃度，按 3 ml/kg 體積腹腔注射給藥。

1.4 儀器 XR-XM101 Morris 水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)，上海欣軟信息科技有限公司制造。本系統(tǒng)由水迷宮儀器: 圓形水池直徑120cm，高50 cm，平臺高度20cm，直徑8cm，迷宮上方置有顯示系統(tǒng)攝像機(jī)，計算機(jī)自動跟蹤并記錄游泳軌跡。XR-3TB 小鼠跳臺測試箱自動記錄系統(tǒng)，上海欣軟信息科技有限公司制造。本系統(tǒng)裝置為一被動回避反射箱，箱底鋪以電柵作為刺激電極，箱內(nèi)左后角置一個高度和直徑均為 4.5 cm 的圓形平臺為回避電擊的平臺區(qū)。

1.5 方法 將水迷宮和跳臺篩選訓(xùn)練合格的小鼠 80 只，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、芎歸湯有效組分劑量 1 ～ 5 組及陽性藥組。芎歸湯有效組分劑量 1 ～ 5 組及陽性藥組分別給予各自治療藥物，按照 25ml/kg 體積每天灌胃，空白對照子給予相同體積生理鹽水，連續(xù)給藥 30 天。

1.5.1 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 新購進(jìn)的昆明種小鼠，穩(wěn)定 3 天后，進(jìn)行 Morris水迷宮篩選實(shí)驗(yàn) 2 次。小鼠進(jìn)行水迷宮篩選前先將小鼠放在平臺上 10 s，讓其認(rèn)知平臺，然后將小鼠從平臺對角象限頭朝臂放入水中，觀察其 2 min 內(nèi)能否找到平臺，能找到平臺的納入正式實(shí)驗(yàn)，不能找到平臺的小鼠人為將其引導(dǎo)上平臺停留 10 s，10 min 后進(jìn)行第二次篩選實(shí)驗(yàn)，能找到的納入正式實(shí)驗(yàn)，兩次都不能找到平臺的小鼠剔除出實(shí)驗(yàn)。將篩選合格的小鼠進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)，每天4 次，上午下午各 2 次，訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)同篩選實(shí)驗(yàn)方法相同，如此連續(xù)訓(xùn)練 10 ～ 15 次，確保每只小鼠都能在規(guī)定的時間內(nèi)找到平臺。實(shí)驗(yàn)時，平臺低于水面 1 cm，水溫 25.0 ± 1.0℃ ，水中加入漂白劑，充分混勻，使水呈乳白色，實(shí)驗(yàn)期間迷宮外參照物保持不變。將小鼠分別由平臺對角象限頭朝桶臂放入水迷中，記錄小鼠在 2 min 內(nèi)尋找平臺的時間( 潛伏期) 及經(jīng)過平臺次數(shù)，作為學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)，找到平臺后允許動物在平臺上停留30 s; 如果小鼠在 120 s 內(nèi)未找到平臺，記為 120 s。測試過程中保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)燈光、物品等空間參照物擺放位置不變，排除干擾因素。

1.5.2 跳臺實(shí)驗(yàn) 將水迷宮篩選訓(xùn)練合格的小鼠分別放入跳臺不同的反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng) 3 min，讓其認(rèn)知環(huán)境，然后立即通以0.2mA電流，定時 5 min，將 5 min內(nèi)能夠認(rèn)知平臺并進(jìn)行躲避電刺激的小鼠納入正式實(shí)驗(yàn)。將不能認(rèn)知平臺的小鼠人工引導(dǎo)其跳上平臺躲避電刺激，再次適應(yīng) 3 min，進(jìn)行第二次跳臺實(shí)驗(yàn)篩選，將兩次都不能找到平臺并躲避電刺激的小鼠剔除出實(shí)驗(yàn)。將篩選合格的小鼠進(jìn)行跳臺訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)，訓(xùn)練方法同篩選方法，如此連續(xù)訓(xùn)練 5 ～ 10 次。參照徐叔云經(jīng)典的藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)中的跳臺實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測試，分兩天進(jìn)行，第一天學(xué)習(xí)，第二天記憶。實(shí)驗(yàn)時，將小鼠放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng) 3 min，然后立即通以0.2mA電流。動物受到電擊，正常的反應(yīng)是跳回平臺以躲避傷害性刺激，多數(shù)動物可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊后又迅速跳回平臺。定時 5 min，分別記錄這兩天小鼠第一次跳下平臺的時間( 潛伏期) 以及 5 min 內(nèi)小鼠跳下平臺受到電擊的次數(shù)( 錯誤次數(shù)) 。

1.5.3 Morris 水迷宮及跳臺實(shí)驗(yàn) 第 31 天給藥后 30 min 除正常對照組外，腹腔注射東莨菪堿造模，給藥劑量為 2 mg/kg，注射體積為 3． 0 ml/kg。造模30 min 后進(jìn)行 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)，觀察記錄各組小鼠在 2 min 之內(nèi)的潛伏期及經(jīng)過平臺次數(shù)。第 32 ～ 33 天進(jìn)行跳臺學(xué)實(shí)驗(yàn)，給藥方法及時間同上。其中第 32 天為跳臺學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)，第 33 天為跳臺記憶實(shí)驗(yàn)，電流控制在0.2mA，定時5 min，分別記錄這兩天小鼠第一次跳下平臺的時間( 潛伏期) 以及 5 min 內(nèi)小鼠跳下平臺受到電擊的次數(shù)( 錯誤次數(shù)) 。綜合分析其學(xué)習(xí)能力的差異性。

1.5.4 芎歸湯藥效 ED50計算 以東莨菪堿致癡呆模型 Morris水迷宮及跳臺實(shí)驗(yàn)潛伏期為指標(biāo)，按照藥效改善大于 25% 的動物，記為陽性，用 Bliss 計算法，確定芎歸湯的藥效 ED50。藥效改善率 =藥物組潛伏期 － 模型對照組潛伏期模型對照組潛伏期× 100%( 藥效改善率 ＞ 25% ，為有效，記為陽性)

3 討論

通過對各組小鼠 Morris 水迷宮及跳臺實(shí)驗(yàn)的比較分析，芎歸湯各劑量組由高到低，學(xué)習(xí)記憶能力逐漸下降，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，劑量 1 組藥理學(xué)效應(yīng)最強(qiáng)。提示，芎歸湯對抗東莨菪堿致癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力衰退具有一定的保護(hù)作用，其效應(yīng)大小隨著劑量的增高而增大，呈現(xiàn)明顯的" 量-效" 關(guān)系。與模型對照組比較，芎歸湯對東莨菪堿致癡呆小鼠 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶能力減退的改善在 10.92 ～ 43.68 g/kg 劑量范圍內(nèi)均有顯著性差異，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其 ED50為 4.79g / kg; 芎歸湯對東莨菪堿致癡呆小鼠跳臺學(xué)習(xí)記憶能力減退的改善在 2.73 ～ 43.68 g/kg 劑量范圍內(nèi)均有顯著性差異，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其 ED50為 2.70g/kg。表明，芎歸湯在跳臺實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出的作用藥效果要優(yōu)于在水迷宮中的表現(xiàn)。

目前關(guān)于 AD 的發(fā)病機(jī)制研究眾說紛紜，沒有一種假說可以完全解釋 AD 的發(fā)生發(fā)展。其中的膽堿能損傷假說是目前比較公認(rèn)的主流學(xué)說之一，其認(rèn)為乙酰膽堿是與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的重要物質(zhì)，而海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要解剖基礎(chǔ)，發(fā)生 AD 時基底前腦區(qū)的膽堿能神經(jīng)元丟失，造成乙酰膽堿的合成、儲存、釋放減少，從而導(dǎo)致以記憶和識別功能障礙為主的多種臨床表現(xiàn)。根據(jù)膽堿能假說研制的東莨菪堿致癡呆模型所造成的記憶障礙形式與老年性健忘癥非常相似，因而廣泛用于動物實(shí)驗(yàn)中建立認(rèn)知功能傷，用以驗(yàn)證藥物的作用。而 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)和跳臺實(shí)驗(yàn)又是研究學(xué)習(xí)記憶能力的最主要的實(shí)驗(yàn)方法，因此，結(jié)合東莨菪堿致癡呆模型，應(yīng)用 Morris 水迷宮和跳臺法對藥物進(jìn)行藥效學(xué)研究就成為抗癡呆藥物的主流方法。但是，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作中筆者發(fā)現(xiàn)，Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)和跳臺實(shí)驗(yàn)均有其不足之處，如個體間的成績差異巨大，動物的回避性反應(yīng)差異較大，需要檢測大量的動物等，因此在進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)綜合運(yùn)用多種行為學(xué)檢測方法，綜合整理分析，進(jìn)行藥效學(xué)評價，用以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)論的準(zhǔn)確性和說服力，為更加有效、精確地進(jìn)行相關(guān)藥物活性篩選和藥效評價提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而加快中藥藥理學(xué)學(xué)科的發(fā)展和提高中藥新藥創(chuàng)制的水平。

因此，本次實(shí)驗(yàn)以 Morris 水迷宮和跳法方法，對芎歸湯有效組分抗東莨菪堿致癡呆模型進(jìn)行藥效學(xué)" 量-效" 關(guān)系綜合評價研究，分析芎歸湯不同劑量組的行為學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)，對抗東莨菪堿致癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力衰退具有一定的改善作用，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴。芎歸湯不同劑量組在跳臺實(shí)驗(yàn)中的學(xué)習(xí)記憶能力衰退效果要優(yōu)于在 Morris 水迷宮中的效果，跳臺藥效 ED50要小于水迷宮中的 ED50。