生物制藥新技術：重組人EPO N-聯(lián)糖基化和O-聯(lián)糖基化的全面表征

"免疫球蛋白G(IgG)形態(tài)是許多蛋白質(zhì)治療藥物的開發(fā)方向。與此同時，各種重組人體激素和酶的問世也讓許多高效的患者療法得以實現(xiàn)。例如，促紅細胞生成素(EPO)α等刺激紅細胞生成的治療藥物很早以前就被用于治療貧血癥。這一增加患者紅細胞數(shù)的療法最早由Epogen®公司商品化，該產(chǎn)品于1989年經(jīng)FDA批準后在美國上市。時至今日，隨著生物制藥行業(yè)的格局不斷發(fā)展以及Epogen專利過期(2013年)，EPO藥品成為了國際和國內(nèi)生物仿制藥市場的仿制對象。

 

盡管促紅細胞生成素α的一級結構相對較小，但它含有3個N-糖基化位點和1個O-糖基化位點。由于糖基化的原因，盡管促紅細胞生成素α的蛋白質(zhì)質(zhì)量僅為18 kDa，但其分子量卻達到30～40 kDa。有趣的是，促紅細胞生成素的糖基化與其功能和血清半衰期密切相關。有研究表明，其糖基譜圖中有兩個屬性與其體內(nèi)活性(包括天線化和唾液酸化作用)呈正相關關系。因此，準確表征促紅細胞生成素治療藥物的糖基化非常重要。此外，研究促紅細胞生成素的糖基化還有另一項重要意義，那就是將詳細的糖基分析作為開發(fā)有效的促紅細胞生成素生物仿制藥的重要途徑。"

 

本應用紀要展示了兩種可用于詳細研究重組人促紅細胞生成素(rhEPO)的N-聯(lián)糖基化和O-聯(lián)糖基化的簡易策略。在本研究中，我們首先快速釋放rhEPO中的N-糖基，對其進行GlycoWorks RapiFluor-MS標記，然后利用靈敏的熒光檢測和質(zhì)譜檢測技術進行親水作用色譜(HILIC)分析。在接下來的平行分析中，我們利用完整蛋白質(zhì)的HILIC分析甄別糖基釋放的rhEPO，以解析O-糖基化的相關信息。

 

 

此前已有許多人對重組人促紅細胞生成素(rhEPO)的糖基化進行過研究。之前的這些研究在很大程度上需要使用多項相關技術。本研究的目標是為EPO分析建立兩種簡易的基于LC的互補方法，分別用于獲取N-糖基化和O-糖基化的相關信息。

 

借助采用新型糖基標記試劑RapiFluor-MS的樣品制備新策略，我們可輕松得到rhEPO的N-糖譜圖。該樣品制備策略基于GlycoWorks RapiFluor-MS N-糖分析試劑盒，分析人員可快速釋放N-糖并采用能提高熒光檢測和電噴霧離子質(zhì)譜(ESI-MS)檢測靈敏度的標記物對其進行標記。在之前的應用紀要中，RapiFluor-MS主要用于分析各種IgG樣品，但除此之外，采用GlycoWorks RapiFluor-MS N-糖分析試劑盒的實驗方案，即使面對rhEPO等高度糖基化的蛋白質(zhì)，分析人員同樣能輕松完成樣品制備。

 

經(jīng)驗證，RapiFluor-MS標記的N-糖適用于進行親水作用色譜(HILIC)分析。因此，RapiFluor-MS的HILIC-熒光-MS分析已成為了一種適用于蛋白質(zhì)N-糖基化詳細研究的強大工具。

 

為了實現(xiàn)上述目的，本研究利用HILIC分析了由rhEPO制備的RapiFluor-MS N-糖樣品。我們選用了最近推出的大孔徑酰胺色譜柱—ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide,300Å,1.7 μm糖蛋白分析專用柱，以期達到最優(yōu)的N-糖分離分析分離度。該色譜柱專為糖肽和糖蛋白等大分子的HILIC分離而設計，而研究表明，其大孔徑顆粒結構還能使高度支鏈化的三天線和四天線N-糖的峰容量增加10–20%，因此該色譜柱也是對通常具有高度天線化結構的EPO N-糖進行HILIC分析的理想選擇。雖然本次分析的樣品量相對較少，但成功獲得了高信噪比的譜圖。

 

熒光檢測的靈敏追蹤有助于分析實現(xiàn)準確的相對定量。雖然我們可以觀察到MS靈敏度隨著N-糖結構的增大而降低，但MS譜圖的信噪比仍然值得我們關注。而RapiFluor-MS試劑和具有更高傳輸效率及靈敏度的新一代MS儀器Xevo G2-XS QTof的結合，讓這些特定數(shù)據(jù)的質(zhì)量得到了保障。

 

該分析方法所具備的色譜和質(zhì)譜級靈敏度簡化了N-糖指認過程，讓分析人員能夠輕松繪制rhEPO N-糖物質(zhì)的N-糖譜圖。

 

本研究分析所得的rhEPO N-糖譜圖中主要包括具有不同N-乙酰乳糖胺延伸結構的四天線、四唾液酸化N-糖(FA4G4S4)，但同時該譜圖中也包括一個對應二唾液酸化雙天線N-糖(FA2G2S2)的高豐度峰。由于四天線與雙天線N-糖的比率與EPO的體內(nèi)活性之間呈正相關性，很明顯該分析能為我們提供非常有價值的信息。通過該N-糖分析可輕松獲得的其它信息還包括唾液酸化的程度以及乳糖胺延伸結構修飾的程度�？偟膩碚f，這些結果表明，采用相對比較簡單的RapiFluor-MS N-糖制備方法及相應的HILIC-熒光-MS分析確實能夠獲得信息量非常豐富的N-糖譜圖。

 

 

由于目前沒有高度可靠的機制能夠從對應蛋白質(zhì)中釋放出O-糖，因此O-糖的表征頗具挑戰(zhàn)性。由于采用PNGase F進行糖基釋放簡便而高效，分析游離糖基成為了一種倍受青睞的N-糖表征方法。除了采用同類型的通用糖苷酶之外，分析人員還通過各種化學方法來釋放O-糖，如利用堿性β消除18或肼解作用19等。但這些釋放機制通常難以實施，而且常常會引入干擾(即所謂的“脫落產(chǎn)物”)。

 

在本研究中，我們沒有采用分析rhEPO游離O-糖的策略，而是開發(fā)了另一種表征策略。我們設計了一套新的工作流程，該流程首先使用GlycoWorks Rapid PNGase F和1% RapiGest™ SF表面活性劑對rhEPO 進行快速糖基釋放，10分鐘之后，我們獲得了一份經(jīng)N-糖基釋放的完整rhEPO樣品，然后采用ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide糖蛋白分析專用柱通過HILIC分離對其進行分析。本研究分析的N-糖基釋放rhEPO分離得到了一系列(約10個)色譜峰。在線ESI-MS提供了十分詳細的信息，有助于我們將rhEPO的蛋白形態(tài)準確分配給各個色譜峰。

 

結果顯示，兩個豐度最高的LC峰分別具有18893.8和19185.3 Da的去卷積質(zhì)量數(shù)，與分別具有三糖和四糖O-糖修飾結構的C端精氨酸截斷N-糖基釋放rhEPO一致。更具體地講，我們觀察到的較輕物質(zhì)的質(zhì)量數(shù)偏移代表了包括1個己糖、1個N-乙酰己糖胺和1個唾液酸結構的糖基修飾。同時，我們觀察到的較重物質(zhì)的質(zhì)量數(shù)偏移則代表包括相同結構的糖基修飾，但多了一個N-乙酰-神經(jīng)氨酸結構。

 

對LC-MS數(shù)據(jù)的進一步研究結果還表明，經(jīng)過O-糖無糖基化的rhEPO蛋白形態(tài)在約8.2min的保留時間處洗脫。此外，這些LC-MS數(shù)據(jù)還表明rhEPO至少還有兩種其它的O-聯(lián)糖型，以及更多種C端截斷的蛋白形態(tài)。由此，我們可以看出該工作流程的確可用于快速分析rhEPO的N-聯(lián)糖基化，幫助我們獲取關于占據(jù)率和異質(zhì)性的信息。

 

 

最近，糖基分析領域出現(xiàn)了幾款基于可兼容親水作用色譜(HILIC)的LC-MS的強大工具。這些新型糖基分析工作流程的核心是專為大分子分離而設計的HILIC色譜柱。借助ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide糖蛋白分析專用柱，分析人員能夠在大分子游離N-糖的分離中實現(xiàn)更高的分離度。這種分析方法與RapiFluor-MS標記聯(lián)用時不僅能提高分離度，還能獲得前所未有的靈敏度。我們在本研究中將該方法成功應用于詳細研究重組人促紅細胞生成素α (rhEPO)的N-糖基化。由于N-糖基化與EPO的半衰期和活性有關，成功獲取這類信息并達到前所未有的數(shù)據(jù)質(zhì)量對于開發(fā)新型EPO治療劑有著無可估量的價值。EPO還具有O-糖基化結構；該結構的占據(jù)率和異質(zhì)性對于研究各種藥物之間的兼容性也具有非常重要的意義。在本應用紀要中，我們概述了一個使用ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide糖蛋白分析專用柱的實驗方案，該方案包括簡單的樣品制備步驟，然后通過隨后的HILIC分離分析完整rhEPO上的O-糖基屬性。概括地講，重組人促紅細胞生成素(rhEPO)分子此前由于其糖基化結構相對復雜，一直被視為糖基化表征的難題，而我們介紹的兩種簡易策略可用于詳細研究rhEPO的N-聯(lián)糖基化和O-聯(lián)糖基化。充分利用這些工具有助于我們加快新型生物仿制藥的開發(fā)進程。