免疫組化實(shí)驗(yàn)過程中的注意事項(xiàng)介紹

如何隨心所欲的做好免疫組化？

免疫組化（Immunohistochemistry) 至今也有八十余年的歷史了，從 1930 年免疫組化的理論被提出討論，一直到 1941 年以帶有熒光色素的抗體，成功地觀察到組織中肺炎雙球菌抗原的存在，至此之后不斷對(duì)于方法改良創(chuàng)新，也就形成了我們實(shí)驗(yàn)中才使用的免疫組化這門技術(shù)，先來淡談一下免疫組化為何八十幾年來還是都是實(shí)驗(yàn)室中的重要的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之一。

人體的器官是由最小單位細(xì)胞所組成的，一般實(shí)驗(yàn)不論是從細(xì)胞研究蛋白或是基因，我們往往都會(huì)想知道通過最小單位的細(xì)胞放大到組織后，我們所研究的蛋白或是基因會(huì)是以何種方式的呈現(xiàn)在組織上呢？這時(shí)不論是研究蛋白 (免疫組化 Immunohistochemistry) 或是研究基因（原位雜交法 chromogenicin situ hybridization，CISH) 就不難理解這兩門技術(shù)的重要性了。

我們首先針對(duì)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行討論，一般做組化的同仁一定會(huì)遇到的頭痛問題，這個(gè)問題也就是背景 (background)，背景的產(chǎn)生來至四面八方，從組織前處理，抗原修復(fù)，免疫阻斷到最后呈色，以上這些都是有可能會(huì)造成背景的產(chǎn)生，所以到此撇開人為因素不談，我們慎選一組好的免疫組化的套組對(duì)整體的實(shí)驗(yàn)是非常的重要。

我們一一的來討論背景是如何產(chǎn)生的，從組織前處理來說，我們最開始取得組織，我們會(huì)經(jīng)過一個(gè)步驟(灌流)，為何要灌流呢？我們首先要知道我們免疫組化最常使用的方法就是 HRP 呈色。那我們把鏡頭拉回我們的組織，我們要知道組織中富含最多 HRP 的就是我們的血球，從這邊大概就可以知道我們?nèi)绻麤]有把血球處理干凈的話,很容易造成在后續(xù)呈色的時(shí)候，會(huì)發(fā)現(xiàn)血球沒有清除干凈的地方就會(huì)產(chǎn)生我們所謂的背景了，另一個(gè)也是清除組織里面血球的方法，也就是我們免疫組化中一定會(huì)使用的過氧化酶去除劑，以上這兩個(gè)方法都是有效去除我們組織上面的 HRP。

另一個(gè)步驟也是組化實(shí)驗(yàn)中一定會(huì)使用到但是往往會(huì)忽略的一步：抗原修復(fù)，為什么要做抗原修復(fù)呢？原因是我們?nèi)〉眯迈r檢體時(shí)通常都會(huì)進(jìn)行甲醛固定這個(gè)步驟，而甲醛固定的這個(gè)過程中會(huì)形成醛鍵，醛鍵是會(huì)封閉抗原的決定族，這種化合物封閉了抗原，一但抗原被封閉后，我們?cè)谶M(jìn)行抗體接合時(shí)，就會(huì)因?yàn)榭贵w無法辨識(shí)抗原因而造成偽陰性的情況，這也就是為什么要做抗原修復(fù)的原因，抗原修復(fù)的方法有很多種，目前最常使用的有以下三種檸檬酸緩沖液（Citrate），EDTA緩沖液，酵素（Enzyme），通常我們最常使用的是檸檬酸緩沖液，主要是它可以進(jìn)行的抗原修復(fù)抗原的種類涵蓋的比較廣，但是還是會(huì)有一些抗原的位置是檸檬酸緩沖液無法處理的，所以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇對(duì)的抗原修復(fù)液，也是很重要的一門功課。

再來談到在實(shí)驗(yàn)中會(huì)使用的免疫阻斷劑，免疫阻斷劑的配方有很多種，但是其實(shí)每一種配方可能只能針對(duì)特定的背景進(jìn)行去除，這時(shí)選擇復(fù)合性的免疫阻斷劑會(huì)對(duì)于實(shí)驗(yàn)更有幫助，其實(shí)我們會(huì)發(fā)現(xiàn)大部分進(jìn)行組化實(shí)驗(yàn)的時(shí)候?yàn)槭裁炊际且岳鲜蠡蚴峭米拥臋z體背景最多呢？其實(shí)這個(gè)問題不難回答，我們翻翻自己冰箱的抗體,大多數(shù)的物種就是來自于老鼠或是兔子，也因?yàn)檫@個(gè)緣故而造成在進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)會(huì)有背景的產(chǎn)生，所以免疫阻斷劑的選擇變成整體實(shí)驗(yàn)非常大的一個(gè)關(guān)鍵。

最后我們討論到的呈色，不過這個(gè)跟實(shí)驗(yàn)法則比較相關(guān)了，我們所使用的 DAB 或是 AEC 呈色，他們的原理是以沉淀的方式進(jìn)行顯色，這也意味著我們呈色的實(shí)驗(yàn)越長(zhǎng)顏色就會(huì)越深，所以對(duì)于呈色的時(shí)間點(diǎn)拿捏也是完成整個(gè)免疫組化非常重要的一個(gè)課題。

綜合以上討論的項(xiàng)目，做組化并不困難，其實(shí)魔鬼藏在細(xì)節(jié)里，我們只要針對(duì)每個(gè)環(huán)節(jié)每個(gè)可能產(chǎn)生背景的部分更細(xì)心去進(jìn)行處理，免疫組化就是一項(xiàng)很簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)了。

再來我們討論一項(xiàng)我們進(jìn)行免疫組織染色實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中會(huì)遇到的問題，一般我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)要研究的蛋白絕對(duì)不會(huì)有一種，我們一定會(huì)看各式各樣的蛋白讓我們研究主題這個(gè)故事更完整，但是一般我們進(jìn)行組化只能染一種可見光的顏色，那如果我們想同時(shí)觀察兩種蛋白在組織上面是相互抑制或是相互增長(zhǎng)等等的表現(xiàn)，我們勢(shì)必會(huì)使用一種染色方法 (雙染 Double stain)，相信雙染在座的各位一定也不陌生，但是你們熟悉的往往都是熒光的雙染，這時(shí)就會(huì)有疑問了，為什么只能做熒光呢？主要是熒光雙染我們是可以利用激發(fā)光的不同分開來拍攝，最后再進(jìn)行圖片的合成，但是這也衍生出其它的問題來，第一個(gè) 蛋白的位置，我們最開始使用免疫組化不就是為了想看我們研究的蛋白是在什么地方表現(xiàn)的嗎？但是如果使用熒光染色就會(huì)明白只有我們蛋白表現(xiàn)的位置會(huì)發(fā)光，而其它的部分全都是黑的，這么一來其實(shí)就很難去討論它表現(xiàn)在組織的位置是否是正確的，另一個(gè)問題 照片的合成，我們以雙染來探討，我們會(huì)先拍 DAPI 也就是核的部分，再來是我們研究的　A 蛋白　跟 B 蛋白，整個(gè)拍完之后再利用軟件進(jìn)行合成，第一點(diǎn)時(shí)間會(huì)耗費(fèi)很久，第二點(diǎn)是合成的時(shí)候萬一背景沒有處理的很干凈因而產(chǎn)生一些非專一性結(jié)合的表現(xiàn)，這時(shí)同時(shí)使用三張圖片合成一張，這個(gè)結(jié)果圖可能會(huì)變得非常不好進(jìn)行數(shù)據(jù)的判斷。

其實(shí)大家心里會(huì)有一個(gè)疑問，為什么不做可見光呢？其實(shí)依照以前的技術(shù)是真的比較不好進(jìn)行可見光的雙染，主要還是因?yàn)榭梢姽獾拿庖呓M化同時(shí)看兩種抗體如果沒處理好反而會(huì)有很臟的背景，相信有想做的同仁一定都遇過上述的問題，不過近年來隨著技術(shù)跟方法的提升，我們已經(jīng)突破會(huì)造成背景的問題了，如此一來針對(duì)上述熒光所帶來的問題，例如我們想在同一個(gè)視野下看到兩種蛋白的表現(xiàn)還有沒有背景的產(chǎn)生，通通會(huì)因?yàn)橛羞@項(xiàng)新的技術(shù)迎刃而解了，以前進(jìn)行雙染有些時(shí)候是沒辦法做可見光才進(jìn)行熒光的，不過這個(gè)問題已經(jīng)解決，相信可見光的免疫組化雙染，這個(gè)新技術(shù)可以為大家的研究更上一層樓。

最后要為大家介紹是最近研究非常熱門的技術(shù)（原位雜交法chromogenicin situ hybridization，CISH）這個(gè)技術(shù)說新其實(shí)也不新，早在 20 世紀(jì) 80 年代末就開始發(fā)展這門技術(shù)，不過當(dāng)時(shí)所研究的重點(diǎn)都放在 DNA 上，但是也因?yàn)榧夹g(shù)門坎高加上成功率也不那么的穩(wěn)定，造成這門技術(shù)我們?cè)跁�上�？吹降�是�?shí)際應(yīng)用其實(shí)不廣，那么為什么會(huì)說是最近開始熱門起來呢？其一、隨著生物科技產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，技術(shù)與學(xué)術(shù)不斷推陳出新，早期遇到的問題都可以輕易破解，其二最近微小 RNA（Micro RNA）變成了一個(gè)主流的研究方向，早期我們不斷的研究著蛋白的表現(xiàn)路徑，隨著學(xué)術(shù)知識(shí)不斷的更新，我們從下游產(chǎn)物蛋白質(zhì)不斷的往上追尋，終于找到了比較前面的源頭也就是微小 RNA，最早我們利用實(shí)時(shí)PCR（Realtime PCR）來進(jìn)行測(cè)定，但是測(cè)定出來的結(jié)果都是一長(zhǎng)串的數(shù)據(jù)分析，人的求知欲是無限的，隨著研究時(shí)間越久人們的求知欲越高，于是回到最一開始我們提到的問題，如果有辦法在組織上看到微小 RNA 的表現(xiàn)不知道會(huì)是什么情形呢，就是這個(gè)想法讓原本沉寂已久的原位雜交法瞬間變成了學(xué)術(shù)及研究界中的新星，這個(gè)方法滿足了我們所有的求知欲，隨著技術(shù)改進(jìn)，原位雜交法實(shí)驗(yàn)步驟變得容易，研究的方向從最早的 DNA，RNA 到最近的微小 RNA 都可以進(jìn)行研究，而另一個(gè)更好的優(yōu)點(diǎn)則是她并不受蛋白質(zhì)裂解的影響，綜合以上優(yōu)點(diǎn)不難理解為什么大家爭(zhēng)先恐后的要使用這門技術(shù)了。

組織研究是在學(xué)術(shù)研究上不可抹滅及取代的一塊研究領(lǐng)域，我們將病理組織相關(guān)研究技術(shù)不斷的研究及推陳出新，一直秉持著走在研究技術(shù)的最前端，在將來我們要把目前最火紅的兩門技術(shù)原位雜交法及免疫組化雙染同時(shí)進(jìn)行在同一個(gè)組織上，也就是意味著我們一個(gè)組織可以同時(shí)看到基因的表現(xiàn)也可以同時(shí)觀察到蛋白質(zhì)的表現(xiàn)，相信這門新興的技術(shù)會(huì)再一次把病理組織這門技術(shù)推上更高的巔峰。

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