基于 Q-Exactive 平臺(tái)和 BioPharma Finder 軟件的簡(jiǎn)單快速抗體藥物二硫鍵解析

聶愛英

賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司

 

Q-Exactive；BioPharma Finder；單抗；二硫鍵解析

 

目前，在全球范圍內(nèi)，單克隆抗體藥物已經(jīng)成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域中最耀眼的一顆明珠。該類抗體藥物具有靶向性專一、特異性高和毒副作用低等特點(diǎn)，代表了藥物治療領(lǐng)域的最新發(fā)展方向，并且在抗腫瘤和自身免疫系統(tǒng)缺陷治療領(lǐng)域得到了強(qiáng)有力的推廣。我國(guó)的抗體藥物產(chǎn)業(yè)也在如火如荼的進(jìn)行中，在抗體藥物的前期研發(fā)和生產(chǎn)質(zhì)控過(guò)程中，抗體藥物的完整分子質(zhì)量、輕重鏈分子質(zhì)量、肽圖、糖鏈、二硫鍵等結(jié)構(gòu)特征信息需要進(jìn)行嚴(yán)格、快速的監(jiān)測(cè)和質(zhì)控，從而保證抗體藥物的有效性和安全性。

 

其中，二硫鍵作為共價(jià)鍵交聯(lián)多肽鏈內(nèi)或鏈間的兩個(gè)半胱氨酸，對(duì)于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、維持正確的空間折疊構(gòu)象、保持及調(diào)節(jié)其生物活性等都起著舉足輕重的作用，尤其對(duì)于生物藥品，二硫鍵的位置和連接情況對(duì)于生物藥物的空間結(jié)構(gòu)、藥物活性等起著關(guān)鍵的作用。X 射線衍射晶體結(jié)構(gòu)解析法、多維核磁共振法、二硫鍵異構(gòu)及突變分析法、酶解法和化學(xué)裂解法等方法都可以用于二硫鍵定位分析，但這些方法普遍存在檢測(cè)速度慢、樣品要求純度高、人工操作復(fù)雜等局限性，不過(guò)，隨著質(zhì)譜儀器在質(zhì)量檢測(cè)范圍、分辨率、靈敏度、準(zhǔn)確度和分析速度等方面的不斷提高，使得質(zhì)譜分析法已經(jīng)可以簡(jiǎn)單、快速的應(yīng)用于二硫鍵的定位分析中，不僅可以實(shí)現(xiàn)已知二硫鍵的確認(rèn)，而且還可以實(shí)現(xiàn)未知二硫鍵的發(fā)現(xiàn)和鑒定，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其它檢測(cè)方法。

 

目前，基于先進(jìn)的四級(jí)桿技術(shù)和超高場(chǎng) Orbitrap 質(zhì)量分析器的 Q-Exactive HF 儀器平臺(tái)，可以為生物制藥分析提供更加快速、靈敏、準(zhǔn)確的二硫鍵、分子量、肽圖、糖鏈等重要信 息。同時(shí)，由國(guó)際領(lǐng)先生物制藥公司 Amgen 和 Thermo Fisher 共同開發(fā)的，為生物制藥公司量身定做的 BioPharma Finder 生物制藥軟件，可以為生物制藥客戶提供抗體藥物相關(guān)的二硫鍵、分子量、肽圖、糖鏈、氨基酸突變位點(diǎn)以及各種后修飾位點(diǎn)等的定性和定量信息。在這里我們主要介紹基于 Q-Exactive HF 儀器平臺(tái)和 BioPharma Finder 生物制藥軟件的簡(jiǎn)單、快速的抗體藥物二硫鍵解析。

 

 

質(zhì)譜儀器：Q-Exactive HF（賽默飛世爾科技，美國(guó)）；

色譜儀器：Easy Nano1000 液相色譜系統(tǒng)（賽默飛世爾科技，美國(guó)）；

色譜柱：自制反相 Nano 色譜柱（C18，2 μm，75×150 μm ，100 Å）；

試劑：色譜級(jí)甲酸、二次去離子水，色譜級(jí)乙腈，鹽酸胍（Sigma-Aldrich，美國(guó)），碳酸氫銨（Sigma-Aldrich，美國(guó)），Trypsin（Promega，美國(guó)）。

 

IgG1類型的單抗藥物置于 6 M 鹽酸胍體系中，室溫變性 1 小時(shí)，使用超濾管進(jìn)行溶液體系置換，終溶液為 50 mM 碳酸氫銨，然后加入 Trypsin、酶和蛋白的質(zhì)量比為 1:40，37 度過(guò)夜酶切，加入 1% 甲酸終止酶切，旋轉(zhuǎn)凍干，備用。（變性時(shí)間和酶解時(shí)間可以根據(jù)樣品的不一致性進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整）

 

色譜分析條件：具體見表 1；

質(zhì)譜分析條件：具體見表 2；

 

表 1. 二硫鍵分析的色譜條件

 

表 2. 二硫鍵分析的質(zhì)譜條件

 

使用 BioPharma Finder 1.0軟件對(duì)原始譜圖進(jìn)行二硫鍵分析，數(shù)據(jù)庫(kù)為抗體藥物對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，搜庫(kù)參數(shù)基本使用軟件的默認(rèn)設(shè)置，勾選二硫鍵搜索，無(wú)需指定二硫鍵可能的鏈接位置，如圖 1 所示。

 

圖 1. BioPharma Finder 1.0 軟件中二硫鍵設(shè)置模塊

 

現(xiàn)在商業(yè)化最多的單克隆抗體為 IgG1 類型的單抗藥物，該類型的抗體中，主要存在 16 對(duì)二硫鍵，其中重鏈內(nèi)部有 8 對(duì)，輕鏈內(nèi)部有 4 對(duì)，輕鏈和重鏈鏈間有 2 對(duì)，重鏈鏈間有 2 對(duì)，考慮到單抗結(jié)構(gòu)的對(duì)稱性，最終，非冗余的二硫鍵共 9 對(duì)。以正在測(cè)試的單抗藥物為例，理論二硫鍵的連接情況如圖 1 所示。

 

 

圖 1. IgG1 類型單抗藥物的二硫鍵連接形式以及正在測(cè)試的單抗藥物的理論二硫鍵的具體連接信息。

 

得益于 Q-Exactive HF 的超高靈敏度、超高質(zhì)量精度和超快采集速度，該測(cè)試抗體藥物的 9 對(duì)二硫鍵連接形式僅在 Trypsin 酶解的肽段產(chǎn)物中就都得到了 100% 的鑒定覆蓋，充分體現(xiàn)出 Q-Exactive HF 的強(qiáng)大定性能力。

 

首先以重鏈中 HC22-HC96 的二硫鍵連接為例，如圖 2 所示，肽段 AEDTAVYYCAK 和 LSCAASGFTFDDYAMHWVR 的二級(jí)碎片信息非常豐富，同時(shí)一級(jí)母離子的質(zhì)量偏差在 1.58 ppm，因此可以準(zhǔn)確、快速的確定二硫鍵的連接情況。

 

圖 2. 肽段 AEDTAVYYCAK 和 LSCAASGFTFDDYAMHWVR（HC22-HC96）的二硫鍵連接二級(jí)碎片譜圖

 

其次，以輕鏈中 LC23-LC88 的二硫鍵連接為例，如圖 3 所示，肽段 VTITCR 和 FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQR 的二級(jí)碎片信息也非常豐富，同時(shí)一級(jí)母離子的質(zhì)量偏差在 1.73 ppm，因此可以準(zhǔn)確、快速的確定二硫鍵的連接情況。

 

 

圖 3. 肽段 VTITCR 和 FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQR（LC23-LC88）的二硫鍵連接二級(jí)碎片譜圖

 

最后，以重鏈鉸鏈區(qū)的兩對(duì)相近的二硫鍵 HC230-HC230和 HC233-HC233 為例，如圖 4 所示，肽段 THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK 和 THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK 的二級(jí)碎片信息也非常豐富，同時(shí)一級(jí)母離子的質(zhì)量偏差在 1.70 ppm，因此可以準(zhǔn)確、快速的確定這兩對(duì)二硫鍵的連接情況。

 

 

圖 4. 肽段 THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK 和 THTCPPCPAPELL

GGPSVFLFPPKPK（HC230-HC230 和 HC233-HC233）的二硫鍵連接二級(jí)碎片譜圖

 

本文基于 Q-Exactive 儀器平臺(tái)和 BioPharma Finder 數(shù)據(jù)分析軟件，實(shí)現(xiàn)了單抗藥物簡(jiǎn)單、快速的二硫鍵解析，為單抗藥物的初期研發(fā)和生產(chǎn)質(zhì)控提供了高效、可靠的分析測(cè)試方法。除此之外，Q-Exactive 系列的質(zhì)譜儀器，憑借其超高的分辨率、超快的掃描速度和超高的質(zhì)量精度，必將助力于生物制藥行業(yè)的深度質(zhì)譜分析。