Orbitrap Fusion Lumos: 基于Q-OT-qIT 平臺(tái)的第二代“三合一”超高分辨質(zhì)譜

張偉

賽默飛世爾科技（中國）有限公司　上�！�201206

 

摘　要　Orbitrap Fusion Lumos 是基于Q-OT-qIT 平臺(tái)的第二代“三合一”質(zhì)譜，通過離子入口、離子透鏡、四極桿、ETD和真空技術(shù)等方面的深度改進(jìn)，將儀器整體性能優(yōu)化至極致。配合“三合一”質(zhì)譜魔法般的功能，Orbitrap Fusion Lumos 能夠有效應(yīng)對蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)最復(fù)雜的分析挑戰(zhàn)。本文從定性定量極限靈敏度、抗污染性能、翻譯后修飾和top-down 解析等方面，介紹了第二代“三合一”質(zhì)譜的性能突破和應(yīng)用進(jìn)展。

 

關(guān)鍵詞　Orbitrap Fusion Lumos, 蛋白質(zhì)組學(xué), 代謝組學(xué), top-down

 

中圖分類號(hào)　TH843

 

 

Zhang Wei

ThermoFisher Scientific, Shanghai 201206, China

 

Abstract　Orbitrap Fusion Lumos is the second generation of “Tribrid” MS based on Q-OT-qIT system. The ion inlet, ion optics, quadrupole, ETD and vacuum system are deeply improved, and the instrument performance is extremely optimized. Combined with various magic functions on “Tribrid”, the new system can effectively face the extreme challenge in proteomics and metabolomics. This paper introduces the improvements and advances of the new “Tribrid” MS, including enhanced qual/quan sensitivity, robustness, PTM elucidation and top-down analysis.

 

Key words　Orbitrap Fusion Lumos, Proteomics, Metabonomics, top-down

 

近年來質(zhì)譜技術(shù)呈幾何式發(fā)展，從過去單一質(zhì)量分析器質(zhì)譜（如單四極桿Q）、到兩個(gè)質(zhì)量分析器組成的串聯(lián)質(zhì)譜（如四極桿- 飛行時(shí)間Q-TOF），再到擁有兩種檢測器的組合型質(zhì)譜（如線性離子阱- 靜電場軌道阱LTQ-Orbitrap），不斷創(chuàng)新與突破。2013 年，Thermo 基于四極桿- 靜電場軌道阱-線性離子阱（Q-Orbitrap-LTQ 或稱Q-OT-qIT）結(jié)構(gòu)，發(fā)展了世界上第一款將三種質(zhì)量分析器集為一體的“三合一”質(zhì)譜Orbitrap Fusion [1]。利用四極桿的高選擇性和寬線性、靜電場軌道阱的超高分辨率和超高質(zhì)量精度、線性離子阱的超高靈敏度和多級(jí)MSn 分析能力，并讓各質(zhì)量分析器相互配合、平行工作，從而獲得革命性的掃描方式、魔法般的分析功能和無與倫比的儀器性能�！叭�合一”質(zhì)譜可以解決從定性鑒定、到結(jié)構(gòu)解析、再到精確定量的所有工作。特別是對蛋白質(zhì)組學(xué)的推動(dòng)，一個(gè)小時(shí)完成了酵母全部蛋白的鑒定，開創(chuàng)了“一小時(shí)蛋白質(zhì)組學(xué)”的先河[2]。

 

2015 年美國質(zhì)譜年會(huì)，基于對Q-OT-qIT 系統(tǒng)的深度優(yōu)化，Thermo 推出了第二代“三合一”質(zhì)譜—— Orbitrap Fusion Lumos�！癓umos”一詞本意是點(diǎn)亮魔杖熒光的咒語，第二代“三合一”質(zhì)譜魔法般的功能和優(yōu)化至極致的性能，配合智能平行運(yùn)行技術(shù)（ADAPTTM）將質(zhì)譜所有部件充分調(diào)動(dòng)起來，相互配合、同時(shí)工作，從而輕松應(yīng)對最復(fù)雜的分析挑戰(zhàn)，就像魔杖熒光一樣照亮未知的分析領(lǐng)域。

 

第二代“三合一”質(zhì)譜使用全新高容量離子傳輸管（HCTT）和電動(dòng)離子漏斗（EDIF），通過大口徑的離子入口透鏡，讓更大量離子進(jìn)入質(zhì)譜，配合主動(dòng)離子束傳輸組件（AABG），有效聚焦和傳輸離子，從而全面突破儀器靈敏度的瓶頸與極限。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，全新的離子入口與離子透鏡設(shè)計(jì)使納升流速和常規(guī)流速的檢測靈敏度分別提高2 倍和5 倍[3]。靈敏度的提高不僅降低了最低檢測限和最低定量限，更有效提升了多級(jí)解析的信號(hào)響應(yīng)，1 ng/mL 噻嗎洛爾（Timolol）碎裂至5 級(jí)，仍然獲得高質(zhì)量的譜圖，實(shí)現(xiàn)精細(xì)結(jié)構(gòu)有效解析。

 

此外，全新三段式四極桿（AQT）的設(shè)計(jì)使被分析物始終處于四極場的穩(wěn)定區(qū)，從而穩(wěn)定地通過四極桿，顯著提高離子選擇效率，避免了選擇窗口邊緣和高質(zhì)量的歧視效應(yīng)。離子透鏡的改進(jìn)再配合全新三段式四極桿，使復(fù)雜樣本高通量鑒定達(dá)到新高度：1 μg HeLa 細(xì)胞總蛋白，140 分鐘梯度，2 次重復(fù)，共鑒定到5211 個(gè)非冗余蛋白。使用0.4、0.7、1.6m/z 三種選擇窗口分別鑒定到5211、5184、5187 個(gè)非冗余蛋白，窗口的縮小沒有降低靈敏度，反而進(jìn)一步排除了共流出肽段干擾，使極低豐度蛋白的鑒定更加靈敏、準(zhǔn)確。癌細(xì)胞系總蛋白分析，分級(jí)12 組分，共鑒定109578 條非冗余肽段，對應(yīng)10210 個(gè)非冗余蛋白，輕松實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組深度覆蓋。此外，進(jìn)一步升級(jí)的“Universal Method”無需針對樣本量優(yōu)化最佳參數(shù)，一個(gè)方法適用于所有未知濃度樣本分析，無論是極低上樣量還是高上樣量都能獲得最佳結(jié)果。

 

復(fù)雜樣本的7x24 小時(shí)連續(xù)分析對質(zhì)譜抗污染能力是一大挑戰(zhàn)，特別是多肽/ 蛋白等大分子量的離子，會(huì)對質(zhì)量分析器產(chǎn)生嚴(yán)重污染，造成靈敏度下降等后果。第二代“三合一”質(zhì)譜的全新預(yù)四極桿（Q00），其結(jié)構(gòu)與主四極桿類似，由具有選擇能力的四根圓桿組成。這樣的設(shè)計(jì)使全新預(yù)四極桿相比常規(guī)預(yù)四極桿，具有更高效的離子預(yù)篩選能力，無論在何種掃描模式下，預(yù)四極桿都會(huì)高效率地將目標(biāo)選擇范圍之外的高分子量離子（通常m/z >1300）排除，阻止高分子量離子進(jìn)入質(zhì)量分析器形成污染[4]。高分子量離子的有效排除極大提高了儀器的抗污染能力，即便是諸如血漿、組織等高度復(fù)雜的臨床樣本，也能在大規(guī)模、高通量的高強(qiáng)度分析下，持續(xù)保持儀器的高靈敏度和低雜質(zhì)噪音。

 

靈敏度和選擇性的提高，使復(fù)雜基質(zhì)中極低豐度蛋白/ 化合物的定量更加靈敏、更加準(zhǔn)確[5, 6]。平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）定量，在200 ng HeLa 基質(zhì)樣品中定量15 條合成肽段（PRTC 重標(biāo)肽），其中10條肽段LOQ 達(dá)5 amol（10-18 mol）及以下，CV 均小于10%。數(shù)據(jù)非依賴采集（DIA），以Q ≤ 0.01 和CV ≤ 20% 為標(biāo)準(zhǔn)，155 分鐘有效梯度從HeLa 細(xì)胞總蛋白中鑒定并定量了44506 條肽段和5277 個(gè)非冗余蛋白，譜圖庫中80% 的蛋白獲得了準(zhǔn)確、可靠的定量信息。基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的Shotgun 定量，使用1 μg TMT 標(biāo)記的HeLa 細(xì)胞總蛋白進(jìn)行同步母離子選擇（SPS）MS3 定量分析，定量肽段數(shù)量比過去提高了37%，若將樣本稀釋100 倍，即10 ng上樣量，定量肽段數(shù)量則提高了300%。第二代“三合一”質(zhì)譜是極低豐度蛋白/ 化合物定量的利器，實(shí)現(xiàn)從shotgun 大規(guī)模定量，到DIA 定量，再到PRM目標(biāo)定量的全面提升。

 

通過ETD 碎裂獲得精確的位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)信息是翻譯后修飾研究的有效手段。傳統(tǒng)ETD 應(yīng)用于臨床研究時(shí)，由于臨床樣本的復(fù)雜性導(dǎo)致ETD 碎裂靈敏度低、碎裂效果差，尚難作為常規(guī)裂解手段用于臨床樣本研究。高清ETD（ETD HD）的發(fā)展徹底改變了ETD 的諸多不足。ETD HD 利用線性離子阱的中段阱穩(wěn)定和儲(chǔ)存母離子，再與熒蒽發(fā)生ETD 反應(yīng)，使靈敏度、動(dòng)態(tài)范圍、二級(jí)譜圖質(zhì)量顯著提高[7]。ETD HD 配合Easy-ETD 源、智能母離子排序、實(shí)時(shí)產(chǎn)物離子觸發(fā)、EThcD/ETciD 等多種創(chuàng)新模式，使復(fù)雜基質(zhì)中極低豐度蛋白的翻譯后修飾分析，特別是糖基化結(jié)構(gòu)解析成為可能。使用ETD HD 分析人血清富集的糖蛋白，2 小時(shí)梯度，2 次重復(fù)，共解析超過1000 種不同糖型結(jié)構(gòu)的完整糖肽，其中大部分是分子量超過5 kDa 的糖肽。第二代“三合一”質(zhì)譜的ETD 已成為一種簡單、高效的碎裂模式，能有效應(yīng)用于復(fù)雜樣本低豐度蛋白的分析。

 

Top-Down 研究經(jīng)過多年的發(fā)展仍面臨諸多瓶頸，而突破瓶頸的關(guān)鍵在于減少完整蛋白在傳輸過程中的損失，以及提高蛋白中間序列的碎裂效率�；�于第二代“三合一”質(zhì)譜的深度高真空技術(shù)（Advanced vacuum technology），通過多種技術(shù)手段組合，進(jìn)一步提高了儀器的整體真空度，特別是C-trap 和Orbitrap 之間的真空度，最大程度避免完整蛋白從C-trap 彈射到Orbitrap 過程中與殘留氣體碰撞造成的損失[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，深度高真空技術(shù)使完整碳酸酐酶檢測的信噪比提高3 倍，再配合ETD HD 碎裂，使碳酸酐酶的碎片覆蓋度從38% 提升到65%。同樣的方法進(jìn)行IgG Top-Down 分析，輕鏈的碎片覆蓋度達(dá)91%，重鏈的碎片覆蓋度達(dá)63%[9]。此外，利用三段式四極桿的高選擇性，使用0.5m/z 窗口篩選不同甲基化程度的組蛋白H3 完整蛋白（18+），實(shí)現(xiàn)分子量相近（間隔僅為0.78 m/z）的不同蛋白變體（Proteoform）的有效隔離和區(qū)分。深度高真空技術(shù)、ETD HD、三段式四極桿等創(chuàng)新技術(shù)的發(fā)展，全面突破了Top-Down 分析的瓶頸，使復(fù)雜樣品的在線LC-MS Top-Down 分析成為可能，Top-Down 研究進(jìn)入新紀(jì)元。

 

綜上所述，第二代“三合一”質(zhì)譜—— Orbitrap Fusion Lumos 通過諸多技術(shù)革新和性能深度優(yōu)化，解決了極低豐度蛋白/ 化合物定性定量、復(fù)雜糖肽結(jié)構(gòu)解析、完整蛋白Top-Down 分析等最具挑戰(zhàn)的疑難問題，能夠有效應(yīng)用于大規(guī)模臨床樣本的7x24小時(shí)高強(qiáng)度檢測。

 

[1] Senko MW, Remes PM, Canterbury JD, et al. (2013) Novel Parallelized Quadrupole/Linear Ion Trap/Orbitrap Tribrid Mass Spectrometer Improving Proteome Coverage and Peptide Identification Rates. Anal. Chem. 85: 11710-11714

[2] Hebert AS, Richards AL, Bailey DJ, et al. (2014) The One Hour Yeast Proteome. Mol. Cell. Proteomics 13: 339-347

[3] Wouters ER, Prasad S, Dunyach JJ. Advancements in Atmospheric-Vacuum Interfaces of Mass Spectrometers with Increased Gas Throughput and Enhanced Sensitivity. ASMS 2015: PN 64478

[4] McAlister GC, Senko M. Pre-filtering Ions in the Source Region to Improve Instrument Robustness and Dynamic Range. ASMS 2015: PN 64475

[5] Blank M, Huguet R, Bomgarden R, et al. Revolutionizing Data Independent Acquisition on q-OT-IT Tribrid Mass Spectrometers. ASMS 2015: PN 64461

[6] Huguet R, Blank M, Soltero N, et al. Low Attomole Limit of Quantification on an Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer. ASMS 2015: PN 64492

[7] Mullen C, Earley L, Weisbrod C, et al. Considerations for Attaining Improved ETD Performance for Top Down Applications. ASMS 2015: 64463

[8] Canterbury J, Izgarian N, Senko M, et al. Improvements for High Resolution Analysis on a Modified Tribrid Mass Spectrometer. ASMS 2015: PN 64468

[9] Sharma S, Mallick P, Stoyanova T, et al. Optimizing Top Down Analysis of Proteins on Orbitrap Fusion ™ Lumos ™ Tribrid ™ Mass Spectrometer. ASMS 2015: PN 64439

 

收稿日期：2015-07-17

作者簡介：張偉（1982-），男，賽默飛世爾科技生命科學(xué)質(zhì)譜產(chǎn)品應(yīng)用工程師，長期從事生物質(zhì)譜、蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究