液相色譜微型化：我們?yōu)槭裁催@樣做？

Evert-Jan Sneekes, Laurent Rieux 和Remco Swart

賽默飛世爾科技，荷蘭阿姆斯特丹

 

液相色譜 (LC) 微型化通常是為了提高靈敏度，這是蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)低豐度肽和蛋白質(zhì)的必然要求。微型化的其他優(yōu)點(diǎn)還包括提高與質(zhì)譜連接的效率并降低溶劑的消耗。如今，微型化液相色譜更容易使用，它的儀器操作和連接方式均與常規(guī)液相色譜系統(tǒng)一樣。這為微型化液相色譜特別是毛細(xì)管和微流液相色譜應(yīng)用于新的工作流程和應(yīng)用領(lǐng)域提供了更多機(jī)會(huì)。

 

RSLCnano、納升液相色譜、毛細(xì)管液相色譜、微流液相色譜、質(zhì)譜、nanoViper

 

微型化液相色譜技術(shù)的發(fā)展始于約三十年前，1987 年出現(xiàn)了首批商品化產(chǎn)品。隨著時(shí)間的推移，納升液相色譜成為生物分析研究不可或缺的工具，尤其是在要求最高級(jí)別靈敏度的蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域。然而，隨著納升液相色譜在蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室中的日常應(yīng)用，人們有時(shí)會(huì)遺忘靈敏度提高的原理。了解這些原理及其實(shí)際影響有助于幫助人們看到微型化液相色譜將如何為蛋白質(zhì)組學(xué)、生物分析等帶來益處。

 

為了解內(nèi)徑較小的色譜柱會(huì)使靈敏度增加這一點(diǎn)，首先必須明確樣品濃度和樣品量之間的差異。這可以歸納如下：

• 液相色譜的樣品進(jìn)樣是指一定體積的某濃度樣品的注入

- 這是一個(gè)固定量：例如 1 μL 1 pmol/μL = 1 pmol

• 進(jìn)樣時(shí)，這個(gè)樣品固定量被液相色譜系統(tǒng)稀釋

- 這將得到一個(gè)新的濃度

• 在相同進(jìn)樣量情況下，較小體積的液相色譜將產(chǎn)生較高濃度

- 與大內(nèi)徑色譜柱相比，內(nèi)徑較小的色譜柱靈敏度更高

 

 

圖1 顯示了在內(nèi)徑分別為4.6 mm 和 75 μm 的色譜柱上注入相同進(jìn)樣量（四條“肽”），顯然后者的濃度更高些。相對(duì)增加的靈敏度可以采用公式1 計(jì)算。

 

 

光學(xué)檢測(cè)器（如紫外檢測(cè)器）和電噴霧質(zhì)譜儀屬于濃度敏感型儀器。它們的信號(hào)與從色譜柱洗脫峰中樣品的濃度成正比。

 

圖2 繪制了不同直徑的色譜柱較直徑為4.6 毫米的色譜柱的靈敏度相對(duì)增加（按公式1 計(jì)算）。從圖中可看出，內(nèi)徑最�。�50 μm 和 75 μm）的色譜柱，其靈敏度在理論上可提高幾千倍。然而，插圖顯示色譜柱內(nèi)徑從4.6 mm 變?yōu)? mm 時(shí)，靈敏度已能得到顯著提高（約20 倍）。在一些不要求絕對(duì)靈敏度，但微型化可以提供其它益處，例如與質(zhì)譜輕松連接，減少溶劑用量（見計(jì)算示例）和廢液處置量并降低成本的情況下，這些色譜柱內(nèi)徑范圍完全適合實(shí)際應(yīng)用。

 

減少溶劑用量：

設(shè)想以如下參數(shù)在內(nèi)徑為 4.6mm 的色譜柱上進(jìn)行分析：

- 流速為1.0 mL / min

- 70％ 流動(dòng)相A

- 2 公升溶劑瓶

所有流動(dòng)相A 將在兩天內(nèi)耗盡。

采用微流速液相色譜法以50 μL/min 的流速運(yùn)行本應(yīng)用，500 mL 的瓶子可維持一周。

 

 

圖2. 一系列內(nèi)徑的色譜柱相較于內(nèi)徑為4.6 mm 的色譜柱靈敏度的相對(duì)提高倍數(shù)

 

計(jì)算得出的靈敏度增量實(shí)際上是常規(guī)和微型化液相色譜應(yīng)用之間的比例因子，而流速是最好的例子。通常情況下，常規(guī)液相色譜中的流速（內(nèi)徑為4.6 mm）為1000-1200μL/min，納升級(jí)液相色譜（內(nèi)徑為75μm）為0.250-0.300μL/min。4000 的比率反映內(nèi)徑為4.6 mm 的色譜柱與納升級(jí)液相色譜柱之間的比例因子，并將導(dǎo)致兩個(gè)色譜柱的線性速度（大致）相同。

 

Thermo Scientific^TM Dionex^TM UltiMate^TM 3000 RSLCnano 系統(tǒng)（圖3）旨在為現(xiàn)代納升液相色譜提供所需的非常低的流速和非常高的壓力。UltiMate 3000 RSLCnano 系統(tǒng)在UHPLC 壓力條件下，提供的流速可低至20 nL/min*、高至50μL/min，使其成為可實(shí)現(xiàn)納升級(jí)、毛細(xì)管級(jí)和微流速液相色譜分析的完美儀器。1 模塊具有內(nèi)置柱溫箱，可支持一系列應(yīng)用，同時(shí)可最大限度地縮短各種元件之間的物理距離。這可使連接管盡可能地縮短。

 

連接管的另一個(gè)重要方面是管路內(nèi)徑。納升級(jí)液相色譜 (20 μm) 的連接管內(nèi)徑大約比常規(guī)管路內(nèi)徑小10 倍。通常，毛細(xì)管級(jí)和微流速液相色譜分別采用內(nèi)徑為50μm 和 75 μm 的連接管。

 

如果正確連接合適的管路，就會(huì)得到最好的結(jié)果。Thermo Scientific^TM Dionex^TM nanoViper^TM 接頭系統(tǒng)可提供廠制、手緊UHPLC 接頭，零死體積。nanoViper 接頭和連接管及色譜柱集于一體，無需工具即可組裝，且沒有引入死體積或連接時(shí)毛細(xì)管斷裂的風(fēng)險(xiǎn)。

* 要求時(shí)才會(huì)提供最低流速

 

 

圖3. UltiMate 3000 RSLCnano 系統(tǒng)、內(nèi)視圖和nanoViper 接頭

 

 

微型化液相色譜通�？煞譃槿�類或三種流速范圍：納升級(jí)、毛細(xì)管級(jí)和微流速液相色譜。納升級(jí)液相色譜是指流速低于1000 nL/min的應(yīng)用，毛細(xì)管級(jí)液相色譜包含低流速范圍 (1–10 μL/min) 的應(yīng)用，而微流速液相色譜涵蓋流速超過10 μL/min 的應(yīng)用。

 

以下是各流速范圍的典型應(yīng)用示例。第一個(gè)也是最常見的示例，納升級(jí)液相色譜應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)工作流程中。在這里，樣品量的限制是使用納升級(jí)液相色譜的主要原因。在第二個(gè)例子中，毛細(xì)管級(jí)液相色譜被應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)肽的定量分析。樣品可能較易得到，但通量也很關(guān)鍵，毛細(xì)管級(jí)液相色譜可做到二者兼顧。對(duì)于第三個(gè)示例，微流速液相色譜被用來提高單克隆抗體 (MAb) 消化物分析中的通量。在這里，樣品量不再是限制因素，但增加的靈敏度和系統(tǒng)耐用性很有價(jià)值。最后，給出一個(gè)非生物分析的例子。

 

在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，研究人員面臨著雙重挑戰(zhàn)。待研究的蛋白質(zhì)濃度低且樣品體積小，導(dǎo)致含量極低。此外，樣品非常復(fù)雜。這些因素促使開發(fā)出納升級(jí)液相色譜系統(tǒng)和具有非常高分離能力的色譜柱，確保特殊應(yīng)用，如圖4 所示�？坪諣� (Köcher) 等人進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)，他們通過在 50 cm 的色譜柱上進(jìn)行8 小時(shí)梯度洗脫，從而在胰蛋白酶消化的HeLa 細(xì)胞中平均鑒別出2516個(gè)蛋白質(zhì)。²

 

圖4. 在75 μm（內(nèi)徑）×50 cm 的納升級(jí)液相色譜柱上經(jīng)10 小時(shí)梯度洗脫后高分辨率分離的大腸桿菌消化物

 

下一個(gè)例子是毛細(xì)管級(jí)液相色譜在目標(biāo)定量工作流程中的應(yīng)用。在本例中，選擇毛細(xì)管級(jí)液相色譜來增加通量、提高耐用性和易用性，同時(shí)保持很高的靈敏度。在內(nèi)徑為300 μm 的色譜柱上分離出添加同位素標(biāo)記肽的酵母消化物。樣品在30 分鐘內(nèi)以流速4μL/min 被分離，并連接到采用標(biāo)準(zhǔn)HESI-II 接口的Thermo Scientific^TM TSQ Vantage^TM 三重四極桿質(zhì)譜儀，在SRM 模式下進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)到10 amol（圖5）。更多詳情可參閱Thermo Scientific 的應(yīng)用報(bào)告583。³

 

圖5. 按不同濃度向500 ng 酵母消化物基質(zhì)中加入肽SAAGAFGPELSR 的提取色譜圖

 

以下微流速示例對(duì)生物制藥行業(yè)中高效率和高通量肽譜圖匹配應(yīng)用特別適用。在這個(gè)特定例子中，首先以6 μL/min 流速通過30 分鐘梯度洗脫分離單克隆抗體消化物。在兩個(gè)連續(xù)步驟中，流速升高至15μL/min，同時(shí)梯度縮短。圖6 顯示了在不降低數(shù)據(jù)質(zhì)量的情況下分析時(shí)間如何縮短到1/3。以類似的方式提高標(biāo)準(zhǔn)粒徑填料液相色譜柱上的流速，可能會(huì)使色譜系統(tǒng)與質(zhì)譜儀的連接變得復(fù)雜，并需要每日更換兩次流動(dòng)相。

 

圖6. 在300 μm（內(nèi)徑）×15 cm 的 Thermo Scientific^TM Acclaim^TM PepMap^TM RSLC 分析柱上加速分析單克隆抗體Lys C 消化物

 

最后，Xiang He 等人展示了微流速液相色譜在法醫(yī)毒理學(xué)等領(lǐng)域取得的可喜成果。4 建立了簡便、高靈敏的方法，可量化分析生物樣品中的大麻素，滿足法醫(yī)毒理學(xué)的需要。這種方法在設(shè)計(jì)和循環(huán)時(shí)間上與典型的標(biāo)準(zhǔn)粒徑填料應(yīng)用類似，但靈敏度更高，可以分析進(jìn)一步稀釋的樣品。法醫(yī)毒理學(xué)者可將這種多用途的工作流程應(yīng)用于其他常見的非法/ 濫用藥物定量分析。試劑的消耗量也會(huì)顯著降低90％以上，并降低質(zhì)譜儀的維護(hù)頻率。

 

液相色譜儀的微型化通常僅被認(rèn)為與蛋白質(zhì)組學(xué)研究所要求的可提供更高靈敏度的納升級(jí)液相色譜相關(guān)。但是，毛細(xì)管級(jí)和微流速液相色譜已大幅度提高了靈敏度。此外，在整個(gè)流速范圍內(nèi)（從納升級(jí)到傳統(tǒng)規(guī)格），可以保證UHPLC 的能力，大大簡化了分析的規(guī)模，而且不會(huì)影響到性能。

 

雖然蛋白質(zhì)組學(xué)仍是納升級(jí)液相色譜應(yīng)用的主要焦點(diǎn)，但在生物制藥和法醫(yī)/ 毒理學(xué)應(yīng)用方面亦有很多潛力。如前所述，用戶使用微型化液相色譜不但能提高靈敏度，而且更輕松地與質(zhì)譜連接，同時(shí)還大幅降低了樣品和溶劑的消耗量。這不但補(bǔ)償了延長的操作時(shí)間，還降低了操作成本。切換到毛細(xì)管級(jí)液相色譜或微流速液相色譜意味著靈敏度和耐用性、通量和易用性之間達(dá)到完美平衡。

 

所以重新回到標(biāo)題中的問題：“液相色譜儀的微型化; 為什么我們這樣做呢？”，因?yàn)橛泻芏囫砸妫?/DIV>

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