使用激光光源進(jìn)行NIR western blot檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)

簡(jiǎn)介

Western blot方法是生物實(shí)驗(yàn)室常用的蛋白檢測(cè)方法之一，自從1979提出至今已有數(shù)十年的歷史。用于分析蛋白的表達(dá)情況。通過(guò)抗原抗體的特異性結(jié)合來(lái)檢測(cè)靶標(biāo)蛋白，常用的檢測(cè)方法有化學(xué)發(fā)光法和熒光方法。熒光檢測(cè)方法由于可以進(jìn)行多重檢測(cè)且信號(hào)穩(wěn)定，越來(lái)越受到大家的青睞。二抗直接標(biāo)記熒光基團(tuán)，熒光信號(hào)強(qiáng)度和目標(biāo)蛋白濃度成比例關(guān)系，而不依賴于酶促反應(yīng)，定量更準(zhǔn)確。NIR近紅外熒光檢測(cè)方法，印跡膜自發(fā)熒光較低，信噪比高。NIR熒光檢測(cè)能獲得高信噪比和高質(zhì)量圖片主要依賴于激發(fā)強(qiáng)度大，精密的激光光源和專(zhuān)業(yè)的光學(xué)元件。

激光光源相比于LED、氙燈/鹵素?zé)舾�容易達(dá)到染料的吸收峰

在成像系統(tǒng)中,光源的選擇基于其激發(fā)特定染料的能力，選擇光源的標(biāo)準(zhǔn)是找到一個(gè)可以傳遞必要能量的可用激發(fā)光（實(shí)際激發(fā)熒光探針的光），同時(shí)又可最小化錯(cuò)誤波長(zhǎng)光浪費(fèi)的標(biāo)準(zhǔn)。激光光源近紅外成像的最大優(yōu)勢(shì)在于更接近普通染料的激發(fā)峰。

例如染料 IR Dye® 700 和Alexa Fluor® 680 在685nm處有個(gè)最大吸收峰(圖1A, 1B,和 表1).Azure Biosystems cSeries成像系統(tǒng)帶有660nm激光光源，而使用LED或者白光（氙燈和鹵素?zé)簦┑募ぐl(fā)光源在630nm左右，染料激發(fā)不完全。

染料IR800和Alexa Flour在780nm有個(gè)最大吸收峰（圖1C,D和表1）。Azure Biosystems cSeries帶有785m的激光光源。而使用LED或者白光（氙燈和鹵素?zé)簦┑募ぐl(fā)光在最大吸收峰偏左的方向，染料激發(fā)不完全。

窄光譜激光減少光泄露的產(chǎn)生

激光器在所選染料的激發(fā)峰內(nèi)提供強(qiáng)大的、精確的激發(fā)。窄光譜激發(fā)相比于弱的、非特異性的LED和氙燈/鹵素?zé)舭坠夤庠聪到y(tǒng)可以消除光泄露和人為背景的產(chǎn)生（圖2）。減少圖像噪音，提高信噪比。

激光檢測(cè)在更短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)更高的靈敏度

激光光源更接NIR染料的最大吸收峰，并且提供更少的光泄露。那么是如何影響成像的呢？使用羊抗兔的 IR 700標(biāo)記的抗體孵育進(jìn)行梯度上樣的印跡膜。印跡膜首先使用LED成像系統(tǒng)曝光30s，然后使用激光成像系統(tǒng)曝光10s（圖3A）。即使成像時(shí)間少3倍，在印跡膜上也可以看見(jiàn)同樣數(shù)量的條帶。激光光源更接近染料的吸收峰，幫助用戶節(jié)省成像時(shí)間。

激光檢測(cè)具有較低的背景

評(píng)判數(shù)據(jù)的好壞信噪比是其中一部分，而并不是完全由信號(hào)強(qiáng)度決定。節(jié)省時(shí)間是其中一個(gè)好處，第二個(gè)好處是，較短的曝光時(shí)間有助于減少背景熒光。信噪比是通過(guò)分析每個(gè)明亮條帶的信號(hào)強(qiáng)度分別除以所選區(qū)域的背景強(qiáng)度所得到（圖3）。短的成像時(shí)間可以減少背景，提高信噪比同時(shí)具有較好的靈敏度。

總結(jié)

激光光源更接近NIR染料的最大吸收峰，激發(fā)強(qiáng)度大具有較少的光泄漏。成像時(shí)間短，自發(fā)熒光低，信噪比高等特點(diǎn)。

AzureC600成像系統(tǒng)是市場(chǎng)上唯一即可做激光近紅外、又可以做化學(xué)發(fā)光、多色熒光western blotting分析的成像系統(tǒng)，滿足實(shí)驗(yàn)室的各種成像需求。

AzureC150和C200為基礎(chǔ)機(jī)型，從C200可升級(jí)至c300、c400、c500和c600機(jī)型。因此，無(wú)需要更換儀器實(shí)現(xiàn)UV、可見(jiàn)光、化學(xué)發(fā)光、多色熒光和近紅外成像的功能。

參考文獻(xiàn)

1.Towbin, H., Staehelin, T., & Gordon, J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS, 76(9), 4350–4354.

2. http://www.coherent.co.jp/document/whitepaper/bio/Lasers_vs_ LEDs_LaserAdvantage_no2_Spectral_Brightness.pdf