LncRNA-DILC阻礙肝癌干細胞更新和增殖
中國工程院院士、第二軍醫(yī)大學王紅陽教授課題組長期從事惡性腫瘤的基礎與臨床研究，對腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子病理機制和細胞信號轉導有重要建樹。近期，該實驗室使用Arraystar LncRNA芯片發(fā)現(xiàn)了與肝癌干細胞的自我更新相關的分子--Lnc-DILC。高表達的Lnc-DILC可以競爭性結合IL-6，阻礙NF-KB /IL-6復合物形成，影響下游STAT3的表達，使肝癌干細胞自我更新受阻。該研究成果發(fā)表在Journal of hepatology (IF:10.59)。（芯片實驗由康成提供技術服務）
研究背景
肝癌（HCC）是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，肝部切除手術是治療肝癌首選方法，術后復發(fā)率高是造成患者預后不良的主要原因。癌癥的復發(fā)可能跟具有自我更新、自我保護、抗凋亡等特點的癌癥干細胞相關。研究肝癌干細胞(LCSCs)被認為是了解肝癌侵襲轉移的途徑之一。LncRNA是一類長度超過200nt的非編碼RNA分子。許多研究證明LncRNA可以與癌癥相關基因相互作用，在多種腫瘤的發(fā)展進程中發(fā)揮重要功能。LCSCs中l(wèi)ncRNA的相關研究報道目前比較少，該篇文章的研究預示著Lnc-DILC不僅可以作為肝癌預后標志物，也有作為治療靶點的可能。
研究思路
文章使用三種肝癌細胞系（Huh7, HepG2, CSQT-2）進行肝癌干細胞（LCSCs）培養(yǎng)，通過美國Arraystar Human LncRNA芯片篩選肝癌細胞(HCC)和LCSCs，獲得差異表達的443個LncRNA，449個mRNA。在三組細胞系中，LncRNA-DILC在LCSCs中表達均下調，qRCR驗證結果與芯片相符。共表達分析(CNC)發(fā)現(xiàn)LncRNA-DILC與多個基因相互作用，qRCR驗證其表達與肝癌干細胞標志物-EpCAM/CD24的表達負相關。確認LncRNA-DILC為后續(xù)研究對象，通過RACE確認序列信息。
為了進一步研究LncRNA-DILC在LCSCs自我更新中的作用，構建過表達和敲低LncRNA-DILC的肝癌細胞進行LCSCs培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)敲低LncRNA-DILC的肝癌細胞中檢測到的EpCAM/CD24表達量和多能性相關轉錄因子（如Oct-4）的表達量均高于過表達組，且形成LCSCs數(shù)量多，增殖快。將敲低和過表達的LncRNA-DILC的LCSCs注射裸鼠皮下組織成瘤，觀察到高表達的LncRNA-DILC顯著抑制了移植瘤的體積，說明其在LCSCs形成的癌擴散中起作用。
作者通過PCR Array 篩選到一些在肝癌干細胞中高表達的信號通路，Western驗證LncRNA-DILC可以與JAK2/STAT3通路互作。對肝癌干細胞進行qPCR驗證，藥物處理實驗，發(fā)現(xiàn)LncRNA-DILC抑制STAT3表達，影響STAT3入核，并降低了LCSCs的耐藥性。癌干細胞中IL-6可以激活JAK2/STAT3的表達，該實驗也觀察到IL-6與LncRNA-DILC的表達呈負相關。序列分析，得到LncRNA-DILC能與IL-6啟動子序列互補配對。RNA pull down驗證二者結合，設計與IL-6相同序列，轉染過表達LncRNA-DILC的LCSCs,發(fā)現(xiàn)其對IL-6的抑制作用消失，而過表達突變的結合序列沒有該效果。進一步，作者檢測了NF-kB與IL-6的結合受過表達的LncRNA-DILC的抑制，從而，揭示了LCSCs中LncRNA-DILC的分子作用機理。
臨床應用方面，作者對195例肝癌患者癌和癌旁組織LncRNA-DILC的表達進行研究，LncRNA-DILC在癌癥樣本中表達量低，與肝癌干細胞特異膜蛋白EpCAM/CD24含量負相關。對肝癌病人的預后效果具有很好的指示作用，可以作為預后標志物。
技術路線
結果展示
圖一、A對芯片檢測到的LCSCs中差異表達的LncRNA和mRNA進行共表達分析，找到和多個基因相互作用的重要LncRNA分子，結合芯片數(shù)據(jù)進一步篩選
B對篩選的Lnc-DILC分子進行qPCR驗證，結果與芯片一致。
圖二、左圖 臨床樣本驗證，LncRNA-DILC在肝癌組織中表達顯著低于癌旁組織 右圖 KM曲線顯示LncRNA-DILC的表達與預后效果顯著相關，LncRNA-DILC的表達降低預后效果差。
圖三、LncRNA-DILC在肝癌干細胞擴增中的作用機制示意圖
研究意義
該研究揭示了高表達的LncRNA-DILC通過競爭性結合IL-6的啟動子，抑制NF-kB與IL-6的復合體形成，從而降低肝癌干細胞IL-6的表達，阻礙下游JAK2/STAT3通路激活，最終抑制肝癌干細胞的擴張。同時，大量肝癌的臨床標本研究表明，LncRNA-DILC的低表達與肝癌的預后不良顯著相關，為肝癌的治療提供了潛在的靶點和預后生物標記物。
作者介紹
王紅陽院士，東方肝膽外科研究所常務副所長，生物信號轉導研究中心及綜合治療二科主任、教授，兼任國務院學位辦生物學科評議組委員、國家自然科學基金委聘任評審專家、國家癌基因及其相關基因重點實驗室主任、中科院分子細胞生物學重點實驗室學術委員會副主任、上海交通大學兼職教授和《中華實驗外科雜志》副主編等職。發(fā)表論文80余篇，獲國家自然科學二等獎、上海市“科技精英”、何梁何利科技進步獎、軍隊科技進步一等獎和上海市醫(yī)學科學一等獎。
原文出處
Long Non-coding RNA DILC Represses Self-renewal of Liver Cancer StemCells via Inhibiting Autocrine IL-6/STAT3 Axis.J Hepatol.2016.
