熒光定量PCR應(yīng)用——腫瘤篇

    腫瘤是是機(jī)體在各種致癌因素作用下，局部組織細(xì)胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控，從而導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的異常病變。學(xué)界將其分為良性和惡性兩大類。腫瘤作為全球疾病致死的重要元兇之一，如果發(fā)現(xiàn)和治療不及時，有可能導(dǎo)致人體消瘦、無力、貧血、食欲不振、發(fā)熱及臟器功能受損等，其后果極為嚴(yán)重。

    實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）技術(shù)是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)，是1996年美國Applied Biosystems公司推出，它是通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，然后利用熒光信號的積累強(qiáng)弱實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知的DNA模板進(jìn)行定量，實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，為全面快速準(zhǔn)確地分析樣本中的各類待檢物質(zhì)提供了嶄新的技術(shù)工具，現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用于實驗室及臨床腫瘤標(biāo)志物的檢測。

    Real-Time PCR與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比其使用了熒光探針標(biāo)記特定核酸從而提高了準(zhǔn)確性；靈敏度提高故使用較少的樣本量，從而減少了樣本消耗殆盡的風(fēng)險，在一小時左右即可出結(jié)果，簡化了傳統(tǒng)PCR方法；全封閉管分析、利用電腦分析軟件對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的實時動態(tài)的檢測和自動定量，定量動態(tài)范圍高達(dá)五個數(shù)量級，且結(jié)果重現(xiàn)性較好，這也提高了檢測的靈敏度和精密度。

Real-Time PCR在腫瘤檢測與治療方面的應(yīng)用：

• 早期診斷、分型

    卵巢癌是婦科死亡率最高的惡性腫瘤，其具有發(fā)病隱匿，進(jìn)展迅速的特點，僅有25%的卵巢癌能在Ⅰ期病變時被發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的患者診斷時都已擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移，故卵巢癌的早期診斷對于卵巢癌患者具有重要作用。人附睪蛋白4（HE4）是近年來發(fā)現(xiàn)的一個新基因，大量的研究表明HE4是一個優(yōu)秀的鑒別卵巢良惡性病變的生物標(biāo)志物，研究人員采用Real-Time PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)晚期卵巢癌經(jīng)過手術(shù)和治療，在復(fù)發(fā)前4~5個月就有HE4升高現(xiàn)象，提示HE4可用于檢測卵巢癌復(fù)發(fā)。

    許多研究者認(rèn)為乳腺癌是一種全身性疾病的局部表現(xiàn)，其治療效果的好壞取決于確診時是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是乳腺癌致死的主要原因，如果可以在亞臨床狀態(tài)就能檢測到微轉(zhuǎn)移，對臨床的診斷、治療及患者的預(yù)后都具有重要的指導(dǎo)性作用。早期乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測與防治是乳腺癌研究的前沿課題，尤其是外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTT)及腋窩淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢測逐漸成為乳腺癌研究的重點。其中常見的標(biāo)志性蛋白有乳腺上皮小黏蛋白（SBEM）、細(xì)胞角蛋白19（CK19）及乳腺株細(xì)胞（hMAM）等。

    經(jīng)研究表明，miR-122與肝細(xì)胞癌分型聯(lián)系密切，miR-122表達(dá)受抑制是肝癌的特征，其主要表現(xiàn)為侵襲能力增強(qiáng)、腫瘤復(fù)發(fā)和患者生存時間減少；采用Real-Time PCR技術(shù)同時聯(lián)合免疫組化等方法對miR-122表達(dá)的檢測對于肝細(xì)胞癌的分型判斷具有重要作用。

• 判斷預(yù)后

    熒光定量Real-Time PCR技術(shù)主要通過檢測化療過程中外周血中腫瘤靶mRNA的動態(tài)變化來對化療敏感性進(jìn)行評估�；�療后CK19mRNA表達(dá)陽性的病人臨床復(fù)發(fā)及病死率明顯增高(P<0.001), 而無瘤生存期及總體生存率明顯降低(P<0.001)。統(tǒng)計分析表明:熒光定量Real-Time PCR檢測化療前后外周血中CK19mRNA表達(dá)水平可作為判斷乳腺癌病人預(yù)后及總體生存率的獨立指標(biāo)。

    研究發(fā)現(xiàn)對于miR-429來說，高miR-429表達(dá)與肝癌的不良預(yù)后相關(guān)。近年來也有越來越多的證據(jù)表明miR-429的表達(dá)與多種腫瘤相關(guān)，如結(jié)腸癌、胃癌、卵巢癌。

• 指導(dǎo)治療

    傳統(tǒng)的臨床評定化療敏感性方法主要是根據(jù)腫瘤的大小變化， 需要在開始治療之后3 ～ 4mo進(jìn)行。而通過檢測腫瘤化療過程中外周血中靶mRNA的動態(tài)變化可以在最初治療之后3 ～ 4wk盡早預(yù)測療效, 這對于決定病人的個體化治療具有重要意義, 尤其對于非實體瘤以及輔助化療病人, 由于沒有可測量的實體病灶, 此種評估化療敏感性的方法顯得尤為重要。

    綜上所述，Real-Time PCR 是在臨床上廣泛應(yīng)用的一種基因定量檢測技術(shù), 它不但能夠準(zhǔn)確定量腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)量, 還可以對外周血中腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行準(zhǔn)確定量, 據(jù)此可以對腫瘤早期診斷, 腫瘤分期、分型,對腫瘤轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)及預(yù)后判斷。但是我們也看到，Real-Time PCR檢測存在假陽性和假陰性等問題，但相信隨著科技的進(jìn)步，采用Real-Time PCR技術(shù)對多個基因進(jìn)行聯(lián)合檢測，進(jìn)行綜合性指標(biāo)分析，或與其他一些技術(shù)諸如反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)、免疫組化法、HE染色法等的結(jié)合應(yīng)用，使得Real-Time PCR技術(shù)在臨床及更多領(lǐng)域上將有更加廣闊的應(yīng)用前景。