細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別和實(shí)驗(yàn)觀測(cè)

    很多實(shí)驗(yàn)小伙伴表示不知如何區(qū)分細(xì)胞凋亡和壞死，其實(shí)細(xì)胞凋亡與壞死是兩種完全不同的細(xì)胞凋亡形式，根據(jù)死亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)上的差別，可以將二者區(qū)別開來。

細(xì)胞凋亡
是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主性、有序性的死亡，他涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用，具有生理性和選擇性的。

生理學(xué)意義

細(xì)胞凋亡對(duì)胚胎發(fā)育及形態(tài)發(fā)生、組織內(nèi)細(xì)胞群的穩(wěn)定、機(jī)體的防疫和免疫反應(yīng)、疾病或中毒時(shí)引起的細(xì)胞損傷和老化、腫瘤的發(fā)生進(jìn)展起著重要作用，并且有著潛在的治療意義。

細(xì)胞壞死

是極端的物理、化學(xué)因素或嚴(yán)重的病理性刺激引起的細(xì)胞損傷和死亡，是非正常死亡。

長(zhǎng)期以來細(xì)胞壞死被認(rèn)為是因病理而產(chǎn)生的被動(dòng)死亡，但是近期的研究表明，細(xì)胞壞死可能是細(xì)胞“程序性死亡”的另一種形式，具有包括引發(fā)炎癥反應(yīng)在內(nèi)的重要生理功能。當(dāng)細(xì)胞凋亡不能正常發(fā)生而細(xì)胞必須死亡時(shí)，壞死作為凋亡的“替補(bǔ)”方式被采用。

細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法有很多，下面介紹常用的形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法。

1.光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

凋亡細(xì)胞的主要特征為核染色質(zhì)致密深染，形成致密質(zhì)塊，有時(shí)可碎裂。在HE染色的組織切片中細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強(qiáng)，并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細(xì)胞常以分散單個(gè)形式存在，凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞分離，不引起炎癥反應(yīng)。

本方法簡(jiǎn)便易行，但在細(xì)胞密集的組織中對(duì)于改變不典型的細(xì)胞判斷較困難，常缺乏較為特征的指標(biāo)，具有較強(qiáng)的主觀性，重復(fù)性差。本方法可用于調(diào)亡現(xiàn)象的初步觀察，作為分析指標(biāo)之一。

1）未染色細(xì)胞：

凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，全面皺縮，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體，凋亡小體為數(shù)個(gè)圓形小體圍繞在細(xì)胞周圍。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。

2）染色細(xì)胞：

姬姆薩（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常細(xì)胞核色澤均一；凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)；壞死細(xì)胞染色淺或沒染上顏色。   

蘇木素-伊紅（HE）染色：細(xì)胞核固縮碎裂、呈藍(lán)黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細(xì)胞），正常細(xì)胞核呈均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色，壞死細(xì)胞核呈很淡的藍(lán)色或藍(lán)色消失。

2.熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。 常用的DNA特異性染料有： Hoechst 33342， Hoechst 33258，DAPI。三種染料與DNA 的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。 

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，能進(jìn)入正常細(xì)胞膜而對(duì)細(xì)胞沒有太大細(xì)胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高。  DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。  

PI和Hoechst33342雙標(biāo)：PI、Hoechst33342均可與細(xì)胞核DNA（或RNA）結(jié)合。但PI不能通過正常細(xì)胞膜，Hoechst則為膜通透性熒光染料，故細(xì)胞在處于壞死或晚期調(diào)亡時(shí)細(xì)胞膜被破壞，這時(shí)可為PI著紅色。

正常細(xì)胞和中早期調(diào)亡細(xì)胞均可被Hoechst著色，但是正常細(xì)胞核的Hoechst著色的形態(tài)呈圓形，淡蘭色，內(nèi)有較深的蘭色顆粒；而調(diào)亡細(xì)胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。故PI著色為壞死細(xì)胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為調(diào)亡細(xì)胞。  

凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

3.電子顯微鏡

雖然光學(xué)顯微鏡下可以看見胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體,但凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化大多發(fā)生在超微結(jié)構(gòu),因此用光鏡觀察難以令人滿意,而透射電鏡可清楚地觀察到細(xì)胞結(jié)構(gòu)在凋亡不同時(shí)期的變化。電鏡形態(tài)學(xué)觀察是迄今為止判斷凋亡最經(jīng)典、最可靠的方法,被認(rèn)為是確定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。

檢測(cè)方法：

透射電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色，透射電鏡觀察。掃描電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級(jí)脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，真空噴金，掃描電鏡觀察。

結(jié)果評(píng)判: 

可見凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實(shí)，細(xì)胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。

缺點(diǎn)：

1）只能定性,不能定量;

2）標(biāo)本處理過程復(fù)雜,設(shè)備相對(duì)昂貴,對(duì)檢查者的技術(shù)水平要求較高,不適于大批標(biāo)本檢測(cè);

3）在組織切片上進(jìn)行電鏡觀察時(shí),有時(shí)凋亡很難與正常細(xì)胞有絲分裂相鑒別,因?yàn)閮煞N情況下都可出現(xiàn)染色質(zhì)濃聚。如同時(shí)進(jìn)行熒光染色,可彌補(bǔ)電鏡檢查的不足。

質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

4.流式細(xì)胞技術(shù)

流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞是通過檢查其光射特征及熒光參數(shù)時(shí)行的。細(xì)胞穿過流式細(xì)胞儀的激光束集點(diǎn)時(shí)使激光發(fā)生散射，分析散射光可以提供細(xì)胞大小及結(jié)構(gòu)的信息。由于光散射牧場(chǎng)生并非凋亡細(xì)胞的特異性指標(biāo)，細(xì)胞的機(jī)械性損傷和細(xì)胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測(cè)與熒光參數(shù)的檢測(cè)結(jié)合起來才能準(zhǔn)確地辨認(rèn)凋亡細(xì)胞。

細(xì)胞凋亡過程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解，導(dǎo)致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細(xì)胞熒光染色后作流式細(xì)胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細(xì)胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細(xì)胞。

細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果直觀,至今仍是判定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的金標(biāo)準(zhǔn),但觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征耗時(shí)費(fèi)力,不適于大量凋亡樣本的檢測(cè)。

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