使用切向流過濾法純化血紅蛋白

​在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，輸血是出血性休克、貧血等病癥重要的治療方法，也是常規(guī)手術(shù)的重要組成部分，但是肝炎及AIDS等小概率傳播風(fēng)險，總是干擾著輸血的安全進(jìn)行。此外，輸血前，還需對供體血液進(jìn)行分型，并與受體血型交叉匹配，以避免出現(xiàn)排異現(xiàn)象。

對此，一種相對簡便的替代方法是，使用血紅蛋白（Hb）類氧載體（HBOCs）取代供體紅細(xì)胞（RBCs），其具有以下優(yōu)點：首先，由于HBOCs表面沒有血型抗原，一般不會引起排異現(xiàn)象；其次，在Hb純化過程中滅活并清除了病毒，所以大大降低了血源性疾病傳播的可能性。

Hb通常從人或牛RBCs（hRBCs或bRBCs）中提取。對純化的Hb進(jìn)行化學(xué)修飾是HBOCs合成的一種主要途徑，化學(xué)修飾型HBOCs可以通過分子內(nèi)交聯(lián)Hb、聚合Hb或?qū)⒕酆衔锝Y(jié)合到Hb表面的方法來完成。Hb也可以包埋到固體或中空顆粒內(nèi)部，以形成非化學(xué)修飾型HBOCs。

從裂解的RBCs中提取并純化Hb前，需先去除血液中的白細(xì)胞、血小板及血漿成分，可先離心并漂洗血液，以分離血漿和白細(xì)胞層。所得的RBCs再用低滲溶液孵育裂解。

從RBC裂解液中純化Hb的方法有很多種，包括有機(jī)溶液萃取以及離子交換層析分離。層析方法又可以大體歸類為吸附方法（Hb被截留在固相介質(zhì)內(nèi)，然后溶劑洗脫）或流穿方法（雜質(zhì)被截留，而Hb被洗脫）。流穿方法消除了吸附和洗脫過程，但與吸附方法相比，所得的Hb純度較低。不過，兩種方法都受到血細(xì)胞裂解方法及裂解狀態(tài)的影響。

在還原劑存在的絕氧條件下進(jìn)行加熱，也可以進(jìn)行Hb的純化。在該過程中熱敏感性蛋白選擇性沉淀，而病毒被滅活，但Hb也有可能因為高溫而失活，所以需要添加穩(wěn)定劑，以防止Hb變性。

過濾也是Hb純化的常用技術(shù)，可有效降低Hb溶液中的病毒載量。但是常規(guī)的過濾技術(shù)通常需要配合化學(xué)修飾和分餾操作，以從未修飾型Hb和其它雜質(zhì)中分離修飾型Hb，且由于細(xì)胞碎片堵塞膜孔，造成流速降低。針對這些問題，本文將介紹一種多階段式過濾方法。在該方法中，大多數(shù)細(xì)胞碎片在第一階段（膜MWCO 50nm）被清除，然后連續(xù)過濾，逐步清除較大的細(xì)胞碎片和分子。該技術(shù)相對簡單，且可同時進(jìn)行Hb的純化和濃縮。

KrosFlo Research 2i [KR2i] 切向流過濾系統(tǒng)

材料 & 方法

RBCs溶液起始處理量為1,000mL，離心后，用等滲鹽水漂洗去除非細(xì)胞性Hb和血漿蛋白，再用PB溶液冰浴裂解RBCs，裂解液終體積為2,000 mL。

儀器使用KrosFlo 研發(fā)用IIi 切向流過濾系統(tǒng)和4根不同孔徑規(guī)格的中空纖維過濾組件：50nm、500kD、100kD和50kD，級聯(lián)流路如下圖所示。組件使用前用去離子水完全浸濕，并進(jìn)行完整性測試。

多階段中空纖維過濾系統(tǒng)示意圖

在每個過濾階段，收集濾液，并循環(huán)回流液，以提高Hb產(chǎn)量。但在階段III，1L的PB溶液進(jìn)行洗濾操作。整個純化工藝在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，濾液及回流液容器置于冰上。每個階段開始和結(jié)束時測量濾液流速和跨膜壓，并在各階段處理結(jié)束后，從濾液中取出10mL，做進(jìn)一步分析。階段I起始過濾量為2,000 mL RBCs裂解液。每次運行結(jié)束后，HF組件、相關(guān)軟管和容器均用0.5M NaOH溶液清洗，以清除可能粘附到HF膜上的蛋白，并降解可能存在的內(nèi)毒素。

使用Bradford、紫外可見光譜、質(zhì)譜等方法對純化所得的Hb進(jìn)行質(zhì)量檢測。

結(jié)果 & 討論

由于濃差極化的原因，在Hb純化的每個階段，濾液流速和回流液體積都會隨時間降低。濃差極化是由于大分子或顆粒積聚在HF膜表面，形成濾餅層，即使在HF膜沒有發(fā)生物理性堵塞的情況下，濾餅層的形成也會降低分子穿過膜的速率。在前兩個階段，大部分蛋白質(zhì)通過HF膜，進(jìn)入濾液容器，而細(xì)胞碎片和大分子則濃縮回流，部分細(xì)胞碎片會堵塞HF膜孔，提高跨膜壓，降低流速。在階段III，大部分Hb被截留在回流液中，而部分Hb（αβ二聚體）進(jìn)入濾液。

蛋白濃度分析顯示，大部分Hb截留在階段III（膜MWCO 100kD）的回流液中，濃度約為5mM，顯著高于離子交換層析方法（0.7 - 1.7mM），而metHb水平（~ 0.5%）低于離子交換層析方法（0.5% - 2%）。純化的Hb中，內(nèi)毒素水平亦低于RBCs原液，內(nèi)毒素主要為脂多糖（~ 10kD），可在階段III（100kD HF膜）過濾去除。

SDS-PAGE顯示，大多數(shù)雜質(zhì)在階段I和II即可去除，而在階段III，通過連續(xù)洗濾，可顯著降低雜質(zhì)含量。在平衡氧結(jié)合特性分析中，純化的Hb（100 kD回流液）各測量值均與RBCs接近，說明TFF過程未改變Hb特性。

對階段III回流液內(nèi)容物進(jìn)行質(zhì)譜檢測，結(jié)果顯示，α、β球蛋白鏈及其聚合物分子量檢測值與理論值保持一致，說明Hb是階段III回流液中的主要成分。

切向流過濾是一種實用、快速的Hb純化及濃縮方法，與其它方法相比，所得Hb純度較高，且metHb水平較低。同時，調(diào)整階段III的洗濾體積，可進(jìn)一步提高Hb純度。