western-blot實驗過程

Western，也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一�？砂凑找韵虏襟E操作。
1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
使用細(xì)胞裂解液，對貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品進(jìn)行裂解。然后測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。

2. 電泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝膠配制
SDS-PAGE凝膠（分離膠及濃縮膠）可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制
 

(2) 樣品處理

   在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制， 100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。

(3) 上樣與電泳
（1）冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。 為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。

（2）電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置 或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可以設(shè)置在120V左右。

（3）為了電泳方便起見，也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在 100V，然后設(shè)定定時時間為90－120分鐘。設(shè)置定時可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過頭。通常電泳時溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計目的蛋白已經(jīng)被適 當(dāng)分離后即可停止電泳。

3. 轉(zhuǎn)膜(Transfer)
（1）我們推薦在Western實驗中選用PVDF膜。硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，轉(zhuǎn)膜時間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過夜。具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大， 需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。

（2）在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時，通常會有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。 轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量最大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春 紅染色液對膜進(jìn)行染色，以觀察實際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。

4. 封閉(Blocking)

 （1）轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。
 

（2）用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60分鐘。對于一些背景較高的抗體，可以在 4℃ 封閉過夜。
 

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)

 （1）參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗。

 （2）用微型臺式真空泵吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果 不佳，可以在4℃緩慢搖動孵育過夜。

 （3）回收一抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。

6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

（1） 參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。

（2）用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。

（3）回收二抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌 3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。

7. 蛋白檢測(Detection of proteins)

（1） 參考相關(guān)說明書，可使用英格恩的Enlight等超敏ECL發(fā)光液來檢測蛋白。
（2）洗片時可以使用X光片自動洗片機(jī)。如果沒有自動洗片機(jī)，可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。

8. 膜的重復(fù)利用(Membrane recovery)

 如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用Western一抗二抗去除液處理蛋白膜，以重復(fù)利用蛋白膜