多重熒光western blot--注意事項

Azure Biosystems公司，我們非常相信熒光多重在Western印跡中的強大功能，這促使了我們的Azure C系列成像儀快速發(fā)展。 但是我們認識到，從標準的HRP /化學發(fā)光方法邁出來是有些艱巨的，所以我們提出了6個注意事項，使化學發(fā)光轉(zhuǎn)換到熒光westernblot盡可能簡單。

我們還在我們的一些以前的應(yīng)用中詳細介紹了相關(guān)內(nèi)容，例如磷酸/總蛋白檢測等等

1.增加濃度 - 與化學發(fā)光Western blot相比，所需的一抗和二次抗體的濃度可能會增加，這也取決于您使用的成像儀系統(tǒng)。 在更現(xiàn)代或激光成像器中，這種影響可能不太明顯。

2.首先進行單色實驗測試 - 首先單獨測試您的抗體非常有意義。 這樣，您可以確定最佳濃度，在簡單的環(huán)境中可以把背景或非特異性的因素考慮進去，而不是一次性分析3種不同的一抗和二抗

3. 使用吸附性二抗 - 雖然聽起來很簡單，但許多人并不考慮他們現(xiàn)在將多種抗體、多個物種加入到單一的印跡中。 如果您在其他領(lǐng)域使用多種熒光，您將已經(jīng)意識到二抗的交叉吸附，減少物種間交叉反應(yīng)性的重要性。 但在western中，很多人并不考慮，這是值得檢查的，以確保他們達到要求。

4. 擴展光譜 - 三色western blot是令人興奮，那五種顏色呢。 使用NIR功能，可以大大增加區(qū)分不同峰。 顯然，這可能需要一些工作進行抗體優(yōu)化，一次用于5個蛋白的檢測可以節(jié)省時間和成本花費。

5. 檢查您的印跡膜 - 盡管越來越多的熒光安全膜正在開發(fā)中，但一些膜在UV光源暴露下發(fā)出自發(fā)熒光產(chǎn)生高背景信號。 我們還建議為增加靈敏度，建議從NC膜切換到PVDF膜上，如前所述。

6. 為您的蛋白選擇合適的通道 - 所有的檢測通道都不是平等創(chuàng)建的。 對于標準熒光，使用藍色通道檢測您的最高豐度蛋白質(zhì)，綠色通道檢測中等豐度蛋白和紅色通道檢測低豐度蛋白質(zhì)。 如果使用NIR，可獲得極好的靈敏度和低背景也是低豐度蛋白質(zhì)的理想選擇。

如果您遵循這些提示，并閱讀我們的一些應(yīng)用指南，則從單一到多通道的轉(zhuǎn)變應(yīng)該非常順利，如果遇到任何困難，我們隨時準備為您提供技術(shù)支持。