步進式平衡透析，藥物-血漿蛋白體外結(jié)合研究
簡介
胰高血糖素樣肽-1可誘導(dǎo)胰島素的葡萄糖依賴性刺激，降低胰高血糖素分泌，可用于2型糖尿病的治療，但其易被二肽基肽酶-4降解，體內(nèi)半衰期僅為1h。利拉魯肽是胰高血糖素樣肽-1類似物，其交聯(lián)到16C脂肪酸殘基，促進可逆的自身締合，并結(jié)合至血漿白蛋白，半衰期可延長至13h。
藥物的血漿蛋白結(jié)合受諸多因素影響，而該過程對于預(yù)測藥物動力學(xué)、藥效學(xué)及計量-反應(yīng)關(guān)系十分重要，對于延長藥物的作用時間也十分關(guān)鍵，所以有必要研究各種因素對結(jié)合過程的影響。
超濾是常用的血漿蛋白結(jié)合研究方法，適用于不會快速代謝或降解的藥物，但疏水性藥物會吸附到膜表面，影響定量。常規(guī)的平衡透析方法也存在該問題。而本實驗使用反復(fù)步進式平衡透析方法，定量檢測利拉魯肽的血漿蛋白結(jié)合。
實驗
利拉魯肽用放射性同位素標記，以便通過液體閃爍計數(shù)方法來定量。利拉魯肽儲液（107 pM）溶于KH緩沖液，然后連續(xù)稀釋，獲得105及103 pM溶液。再以血漿10倍稀釋，獲得106、104和102 pM溶液。
實驗使用15mL Nunc Minisorb 離心管為外室，用利拉魯肽緩沖液預(yù)包被（37℃ 30min，然后過夜），然后將含有特定濃度利拉魯肽血漿孵育溶液的Spectra/Por 15kD 纖維素酯即用型透析袋放入外室內(nèi)，37℃攪拌孵育4-5h。孵育結(jié)束后，從內(nèi)室和外室分別取樣檢測。實驗分別測試了利拉魯肽濃度106、104和102 pM，膜內(nèi)外濃度比100:1和50:1條件下的藥物結(jié)合率，并通過測試日內(nèi)/日間差，評估實驗重現(xiàn)性。實驗同時檢測了利拉魯肽與人血清白蛋白（HAS）及α1-酸性糖蛋白（AAGP）的結(jié)合。
平衡透析實驗設(shè)置如圖所示，兩個室內(nèi)均有利拉魯肽，以避免其被透析膜捕獲。實驗在不同跨膜濃度比條件下進行，直到藥物過膜流動極低，說明整個系統(tǒng)已達到平衡。
結(jié)果
實驗日內(nèi)及日間變異系數(shù)分別為0.1%和0.11%，說明具有良好重現(xiàn)性。臨床濃度（104pM）利拉魯肽的蛋白結(jié)合率可達98-99%，稀釋至102pM不會影響其結(jié)合度。HSA是豐度最高的血漿蛋白，而AAGP水平在某些疾病狀態(tài)下會急劇升高，實驗顯示104pM利拉魯肽（膜內(nèi)/外比為100:1）與兩者結(jié)合率可達99%。
與大多數(shù)血漿蛋白結(jié)合藥物一樣，只有未結(jié)合的利拉魯肽可與效應(yīng)器作用，產(chǎn)生藥理反應(yīng)。分析顯示98-99%的利拉魯肽可結(jié)合至血漿蛋白，亦即在臨床相關(guān)濃度（104pM）條件下，未結(jié)合利拉魯肽的濃度為100-200pM，與利拉魯肽半數(shù)最大效應(yīng)濃度相當。如藥物的血漿蛋白結(jié)合程度發(fā)生改變，將會影響其容積分布和清除速率。
血漿蛋白水平的降低會影響利拉魯肽的蛋白結(jié)合，2型糖尿病常伴發(fā)肝或腎損傷，導(dǎo)致HSA水平降低或低蛋白血癥，但實驗顯示，利拉魯肽的藥物動力學(xué)狀態(tài)不受其影響。
16C脂肪�；嚯牡挠H脂特性使其很難通過超濾法檢測血漿蛋白結(jié)合，因為會被過濾膜“捕獲”。在本實驗中，將利拉魯肽溶于在血漿/蛋白孵育溶液和緩沖孵育溶液中，防止了親脂性分子被透析膜捕獲，此外，對外室進行預(yù)包被，防止了藥物因吸附到外室表面導(dǎo)致?lián)p失，兩者結(jié)合，保證了利拉魯肽血漿蛋白結(jié)合的準備測量及實驗的重現(xiàn)性。
反復(fù)步進式平衡透析適用于利拉魯肽蛋白結(jié)合的體外定量檢測，結(jié)果顯示其結(jié)合率高約~99%，使其作用期較長的原因。由于血漿蛋白的生理水平相對利拉魯肽較高，所以結(jié)合不會受低疾病狀態(tài)下的低白蛋白水平影響。該方法將來也可用于檢測其它親脂性藥物分子的血漿蛋白結(jié)合效應(yīng)。
詳細內(nèi)容，請參考原文：Plum A., Jensen L. B., Kristensen J. B., In Vitro Protein Binding of Liraglutide in Human Plasma Determined by Reiterated Stepwise Equilibrium Dialysis. Journal of Pharmaceutical Science, 2013, 102(8): 2882 – 2888.
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