crystal數(shù)字PCR如何實(shí)現(xiàn)的核酸絕對定量？

crystal數(shù)字PCR技術(shù)是一種核酸分子的絕對定量技術(shù)，原理是將PCR反應(yīng)體系分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每個(gè)微反應(yīng)器中包含或不包含 1 個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)核酸分子 (DNA 模板) ，進(jìn)行"單分子模板"PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，通過陽性反應(yīng)單元(通過終點(diǎn)熒光信號判斷)的數(shù)目和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算原始樣本中靶基因的拷貝數(shù)。工作流程包含4個(gè)主要環(huán)節(jié)，即樣本DNA/RNA的PCR/RT-PCR反應(yīng)預(yù)混、反應(yīng)預(yù)混液的分散或分區(qū)、PCR擴(kuò)增、熒光信號的采集與數(shù)據(jù)分析（如下圖所示）。

Crystal數(shù)字PCR將樣本DNA分散到25000-30000萬個(gè)微滴中，使每個(gè)微滴中包含或者不包含1個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子(DNA模板)，所有微滴以2D陣列的形式單層隨機(jī)平鋪在sapphire芯片中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后讀取各個(gè)反應(yīng)單元的陰性或陽性熒光信號并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析，就可以計(jì)算出原始樣本的模板拷貝數(shù)。那么我們?nèi)绾伪ＷC每個(gè)微滴中只有一個(gè)DNA分子呢？

舉例說明：將100個(gè)DNA分子分散到100個(gè)微滴里，理想情況下，我們希望100個(gè)DNA分子平均分布100個(gè)微滴中如下圖中A圖所示，但是實(shí)際情況是100個(gè)DNA分子以隨機(jī)的狀態(tài)分布在100個(gè)微滴中，如下圖中B圖所示。

A．理想情況下的平均分布B．實(shí)際情況下的隨機(jī)分布

圖：DNA分子的平均分布（理想情況，A圖）和隨機(jī)分布（實(shí)際情況，B圖）

如上由于目標(biāo)DNA分子隨機(jī)分布于陽性反應(yīng)單元中，直接進(jìn)行對陽性反應(yīng)單元進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，不是真實(shí)的目標(biāo)DNA分子拷貝數(shù)，每個(gè)反應(yīng)單元中可能含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的目標(biāo)分子，這時(shí)可以使用泊松概率分布公式（1）進(jìn)行計(jì)算。

（1）

上述公式（1）中，λ為每個(gè)反應(yīng)單元中含有的起始 DNA 分子平均拷貝數(shù)，p為在一定的λ條件下，每個(gè)反應(yīng)單元中包含k拷貝目標(biāo)分子的概率。λ由樣品溶液的稀釋系數(shù)m（或者分區(qū)數(shù)）決定，即λ=cm，其中c為樣品的原始拷貝數(shù)。當(dāng)k=0時(shí)，即不含目標(biāo)DNA分子時(shí)，p即可為無熒光信號反應(yīng)單元數(shù)與反應(yīng)單元總數(shù)的比值，也就是陰性反應(yīng)單元的比例，公式（1）可簡化為公式（2）：

（2）

通過終點(diǎn)法檢測，可以的到總反應(yīng)單元數(shù)n和有熒光信號的陽性反應(yīng)單元數(shù)f，所以陰性反應(yīng)單元的比例即為公式（3）。

（3）

因此得到下面等式：

（4）
對上式兩邊同時(shí)以e為底取對數(shù)，得到下面等式：

（5）

也就是說利用數(shù)字PCR方法進(jìn)行核酸絕對定量時(shí)，只需要通過陰性反應(yīng)單元的比例和樣品的稀釋系數(shù)（或分區(qū)數(shù)）即可確定反應(yīng)單元的平均核酸拷貝數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)DNA的精確定量。這就是數(shù)字PCR技術(shù)如何實(shí)現(xiàn)核酸絕對定量的本質(zhì)。

泊松分布應(yīng)用與數(shù)字PCR結(jié)果校正的前提是需要事件均勻一致，包含微滴的體積、幾何參數(shù)、PCR反應(yīng)條件。Crystal 數(shù)字PCR通過自動(dòng)化微滴陣列的方式，實(shí)現(xiàn)了微滴的均勻一致和反應(yīng)條件一致的同時(shí)，通過軟件自動(dòng)對微滴的幾何參數(shù)進(jìn)行質(zhì)控，并可溯源到單個(gè)微滴，給出最可靠的數(shù)據(jù)結(jié)果。微滴單點(diǎn)溯源