IHC/ICC/IF實(shí)驗(yàn)前需要知道的幾個(gè)要點(diǎn)~！

IHC/ICC/IF ,傻傻分不清楚？它們都是用于定位檢測(cè)抗原表達(dá)的免疫檢測(cè)技術(shù)，由于技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單且直觀，在科研和臨床上都得到了大量使用。但是影響最終檢測(cè)效果的變量非常多；每一個(gè)具體的檢測(cè)都會(huì)遇到多個(gè)需要調(diào)整的變量。具體到選擇何種方法來(lái)保存組織樣本；固定標(biāo)本該用醇還是醛；如何選擇最合適的一抗；抗原修復(fù)具體該用什么樣的方法及條件等等一系列的問(wèn)題都需要考慮。

 因此在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，最好先掌握以下幾組免疫檢測(cè)技術(shù)中的常識(shí)，能夠分清它們的特點(diǎn)將使你做出更好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，提高實(shí)驗(yàn)成功率。

石蠟切片VS冰凍切片

▶ 石蠟切片

石蠟包埋是最廉價(jià)且常用的組織包埋法，適用于需要長(zhǎng)期保存的標(biāo)本。在包埋之前須先將樣本固定，固定時(shí)間通常在4~24小時(shí)，需要考慮過(guò)度固定導(dǎo)致的抗原被遮蔽。在不能立即包埋的情況下，固定完成后的組織可以暫存在乙醇中。如果用樹(shù)脂替代石蠟做包埋劑，可以得到更薄的組織切片（1.5μm vs. 5μm）。石蠟切片步驟繁多，制片中抗原活性有所減低，但組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)清晰，是免疫組織化學(xué)常規(guī)制備切片方法。

▶ 冰凍切片

冰凍切片無(wú)法長(zhǎng)期保存，而且冷凍過(guò)程中冰晶形成容易影響亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使得組織結(jié)構(gòu)不如石蠟切片清晰。冰凍組織切片可以在-80℃ 保存一年。冰凍切片步驟簡(jiǎn)單快速，樣本不需要固定即可直接用液氮或者液態(tài)異戊烷、干冰等進(jìn)行冰凍處理。冰凍和切片之后用乙醇固定切片可以避免表位被甲醛交聯(lián)，無(wú)需進(jìn)行抗原修復(fù)。

在檢測(cè)諸如磷酸化或者一些對(duì)有機(jī)溶劑或熱的溫度耐受能力較差的細(xì)胞膜表面抗原和水解酶時(shí)，采用冰凍切片是很好的選擇。

 

甲醛固定VS醇固定

▶ 甲醛固定

甲醛是用于保存蛋白最常用的固定劑。甲醛能夠在多種蛋白質(zhì)末端基團(tuán)之間形成交聯(lián)，從而達(dá)到固定的效果。但是甲醛固定會(huì)改變抗原表位且阻止抗體結(jié)合。因此常常用酶消化或熱抗原修復(fù)法來(lái)使蛋白與甲醛交聯(lián)的醛鍵斷裂開(kāi)，以便后續(xù)染色。在檢測(cè)磷酸依賴型的表位，選用冰冷的無(wú)水甲醇或無(wú)水乙醇來(lái)固定更為合適。

▶ 醇固定

常用的醇類固定劑有甲醇和乙醇，其固定的原理是與水競(jìng)爭(zhēng)蛋白質(zhì)中的氫鍵，從而替代組織中的水分子，在影響蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的同時(shí)穩(wěn)定其二級(jí)結(jié)構(gòu)。醇類會(huì)溶解脂類物質(zhì)、并且對(duì)組織收縮較大，因此通常認(rèn)為醇類固定不利于保護(hù)組織形。由于醇類固定會(huì)在組織表面很快形成一層蛋白膜，這層膜會(huì)影響固定液滲透，造成中間的組織固定不佳，因此醇類通常用于，固定冰凍組織切片和細(xì)胞，更適合于細(xì)胞膜表面抗原。醇固定之后不建議進(jìn)行抗原修復(fù)，避免破壞樣本完整性。

 

組織固定VS細(xì)胞固定

▶ 組織固定

全動(dòng)物灌流固定往往是保存抗原的最佳方法，適用于對(duì)小鼠、大鼠和豚鼠的完整組織的研究。剝離出來(lái)的組織可以用固定劑浸泡固定。常用的固定劑是是 PBS 配制的 4% 甲醛溶液。厚度在10 mm內(nèi)的組織比較有利于固定劑滲透。為增強(qiáng)固定劑的穿透，。對(duì)于完全固定，固定劑的體積至少是組織體積的 50～100 倍。

▶ 細(xì)胞固定

細(xì)胞的固定比組織固定所需時(shí)間更短，可以使用濃度更低的固定劑。一般來(lái)說(shuō)用 2% 的甲醛溶液在室溫下固定 20 分鐘就足以保存細(xì)胞形態(tài)和抗原性。大部分細(xì)胞只要去除培養(yǎng)基然后加入固定劑即可，對(duì)于一些去除培養(yǎng)基后會(huì)受到表面張力破壞的細(xì)胞，可以直接加入與培養(yǎng)基等體積的固定劑，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)固定。兩分鐘后，去掉預(yù)固定培養(yǎng)基，加入新鮮的 2% 的固定劑繼續(xù)完成固定即可。

 

熱誘導(dǎo)修復(fù)VS酶誘導(dǎo)修復(fù)

▶ 熱誘導(dǎo)的表位修復(fù)（HIER）

在抗原修復(fù)過(guò)程中需要考慮抗原、抗體、組織類型、固定方法及持續(xù)時(shí)間等因素，因此需要針對(duì)各因素來(lái)優(yōu)化修復(fù)方案。常用的熱誘導(dǎo)表位修復(fù)可以用各類加熱設(shè)備開(kāi)展，微波爐是最為方便的設(shè)備，選擇適合的熱修復(fù)緩沖液在適當(dāng)?shù)臏囟群蜁r(shí)間下能夠達(dá)到不錯(cuò)的修復(fù)效果，這些條件都是需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定的。在HIER法中，最重要的一點(diǎn)是修復(fù)完成后讓玻片自然冷卻，因?yàn)閺?qiáng)制冷卻會(huì)使得蛋白質(zhì)難以恢復(fù)原有構(gòu)型。

▶ 蛋白酶誘導(dǎo)的表位修復(fù)（PIER）

蛋白酶誘導(dǎo)的表位修復(fù)作用機(jī)制是酶切割可能掩蓋表位的肽段，常用蛋白酶 K、胰蛋白酶和胃蛋白酶等進(jìn)行修復(fù)，PIER 方法由于可能破壞組織形態(tài)和目的抗原，且成功率較低，通常較少使用。

與比單克隆抗體相比，多克隆抗體能識(shí)別多個(gè)表位，即使不進(jìn)行抗原修復(fù)，檢測(cè)到抗原的可能性也很高。

 

單克隆一抗VS多克隆一抗

單克隆抗體由于其來(lái)源于單個(gè)B細(xì)胞，具有高親和力和以及針對(duì)單個(gè)抗原表位的高特異性。單抗在抗原能夠保持天然構(gòu)象的時(shí)候結(jié)合效果最好，一旦抗原構(gòu)象發(fā)生改變，其結(jié)合效果就會(huì)大打折扣。因此單抗與抗原的結(jié)合容易受到溫度、pH、固定、鹽濃度以及翻譯后修飾、蛋白質(zhì)相互作用等因素的干擾。

多克隆抗體可識(shí)別多個(gè)表位，因此它們較少受到蛋白構(gòu)象變化的影響。通常多克隆抗體對(duì)pH變化和鹽濃度影響下的穩(wěn)定性也比單克隆抗體更好。因此在IHC/ICC實(shí)驗(yàn)中更多的選擇多克隆抗體。

 

直接檢測(cè)VS間接檢測(cè)

高表達(dá)的抗原一般可以通過(guò)直接檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)。直接檢測(cè)不受二抗非特異性結(jié)合的干擾，在進(jìn)行多色檢測(cè)的時(shí)候操作更加簡(jiǎn)單。但是檢測(cè)的靈敏度有限，對(duì)于低表達(dá)的抗原無(wú)能為力，因此該方法的運(yùn)用受到抗原豐度的限制。

間接檢測(cè)方法通過(guò)每一個(gè)一抗與至少兩個(gè)二抗結(jié)合來(lái)放大檢測(cè)信號(hào)，因此檢測(cè)限更低，能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的信號(hào)。但是由于需要結(jié)合二抗而增加了封閉和對(duì)照。

最常見(jiàn)的生物素—親和素系統(tǒng)（Biotin-Avidin—System，BAS）幾乎可與目前研究成功的各種標(biāo)記物結(jié)合。生物素與親和素之間高親合力的牢固結(jié)合以及多級(jí)放大效應(yīng)，使BAS免疫標(biāo)記和有關(guān)示蹤分析更加靈敏。目前廣泛用于微量抗原、抗體定性、定量檢測(cè)及定位觀察研究。鏈霉親和素與親和素一樣，每一分子能結(jié)合4分子生物素，同時(shí)鏈霉親和素不帶任何糖基，避免了項(xiàng)親和素一樣與細(xì)胞表面的多糖發(fā)生非特異結(jié)合。因此采用生物素化二抗與親和素或鏈霉親和素孵育可以明顯放大信號(hào)。

 

熒光檢測(cè)VS顯色檢測(cè)

 

▶ 熒光檢測(cè)

熒光檢測(cè)是基于熒光色素的使用，它們?cè)谑艿捷^短波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)發(fā)光。熒光色素可直接與一抗或二抗結(jié)合，或與鏈霉親和素結(jié)合。免疫熒光常用于多個(gè)細(xì)胞目標(biāo)的同時(shí)觀察。例如，組織可與不同的一抗混合物孵育，再與結(jié)合有熒光色素的二抗孵育，這些熒光染料在不同波長(zhǎng)下發(fā)光。

多色實(shí)驗(yàn)必須經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)，以限制檢測(cè)試劑之間的交叉反應(yīng)性，以及所使用的熒光染料在光譜性質(zhì)上的交叉。為了限制二抗之間的交叉反應(yīng)性，一抗應(yīng)來(lái)自不同的物種。這樣就能使用物種特異的二抗，分別只識(shí)別一個(gè)一抗。

_{來(lái)源R&DSystems}

相關(guān)鏈接：

• 免疫組化（IHC）
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