上樣質(zhì)控和抗體驗(yàn)證用于Western blot定量

今天的帖子的靈感來(lái)自于我和同事在教他們SDS-PAGE和western blot的實(shí)驗(yàn)交談中。 他們對(duì)于qRT-PCR（R）和流式細(xì)胞術(shù)（R）精通，特別關(guān)心如何以及為什么使用某些上樣質(zhì)控，還有其它的技術(shù)被使用驗(yàn)證，蛋白質(zhì)表達(dá)和抗體特異性的變化。

樣品準(zhǔn)備和上樣質(zhì)控

理想地，上樣質(zhì)控是多步驟過(guò)程的一部分，以確保將標(biāo)準(zhǔn)量的蛋白加載到所分析的每個(gè)樣品的凝膠上。 分離樣品的第一步通常是進(jìn)行蛋白測(cè)定，BCA和Bradford測(cè)定法是最流行的兩種，允許在開(kāi)始測(cè)定之前標(biāo)準(zhǔn)化樣品濃度。 第一步的幾個(gè)技術(shù)問(wèn)題，排除污染物質(zhì)的干擾，準(zhǔn)備或者分離樣本。 考慮到這個(gè)原因，應(yīng)與蛋白質(zhì)測(cè)定一起考慮其預(yù)分離標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)，例如使用恒定樣品量或細(xì)胞數(shù)。

一旦樣品開(kāi)始分離和轉(zhuǎn)移，經(jīng)常被忽視的對(duì)照是要進(jìn)行膜染色，我在前一篇文章中討論過(guò)。 免染膠和麗春紅染色是檢驗(yàn)轉(zhuǎn)移效率的一種很好的驗(yàn)證技術(shù)，但是如果加載了相等量的樣品，樣品也應(yīng)該看起來(lái)大致相似。 利用現(xiàn)代圖像采集和分析技術(shù)，還可以使用麗春紅（R），考馬斯藍(lán)（R）和免染方法（R）進(jìn)行基于蛋白質(zhì)（R）的總蛋白定量。 然而，由于在轉(zhuǎn)印后進(jìn)行麗春紅染色，與PVDF和硝酸纖維素膜結(jié)合，并且也很容易洗掉，因此很難將其推薦到其他技術(shù)上。

所以，加載上樣質(zhì)控。 大多數(shù)人都喜歡用beta-actin和GAPDH作為內(nèi)參。 然而，應(yīng)該考慮組織類型，感興趣的蛋白定位和大小，因?yàn)樵谖墨I(xiàn)中有許多實(shí)例證明加載內(nèi)參確實(shí)變化很大（R，R，R）。 這是一個(gè)很好的資源，詳細(xì)說(shuō)明了一些加載內(nèi)參以及其分子量和細(xì)胞定位，但是需要閱讀文獻(xiàn)來(lái)評(píng)估以前的研究。

然而，在樣品制備和分析western blot定量過(guò)程中執(zhí)行所有三個(gè)質(zhì)控步驟，蛋白定量應(yīng)變得輕而易舉，特別是如果使用生物成像系統(tǒng)進(jìn)行多重標(biāo)記成像，允許上樣質(zhì)控和感興趣的樣品同時(shí)顯現(xiàn)，總蛋白定量和校正。

Western blotting中的抗體質(zhì)控

抗體對(duì)照，在Western blotting中，與FACS或免疫組織化學(xué)（IHC）等其他基于抗體的技術(shù)相比，這一領(lǐng)域通常被忽略。 部分原因是由于電泳期間蛋白質(zhì)的分離，這使得確定抗體特異性更容易。 然而，總是值得考慮引入對(duì)照進(jìn)行驗(yàn)證的重要性，特別是對(duì)于印記膜的定量。

陽(yáng)性和陰性

陽(yáng)性對(duì)照是Western印跡中最廣泛使用的，有幾種類型可用。 全長(zhǎng)重組蛋白質(zhì)作為理想的陽(yáng)性對(duì)照，因?yàn)樗鼈儜?yīng)該與天然蛋白分離是相同的，如果產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以用作進(jìn)一步定量的標(biāo)準(zhǔn)品。 然而，重組蛋白不能使用的，因?yàn)槌杀究赡苁橇钊送�而卻步的。 在這些情況下，可以使用陽(yáng)性細(xì)胞或組織樣品，包括已被修飾以過(guò)度表達(dá)感興趣的蛋白的樣品。

在另一個(gè)方向上，陰性對(duì)照樣品也可能被用上，使用完整的空白，更好的對(duì)照是缺乏目的蛋白的裂解物。 如果感興趣的蛋白質(zhì)是相對(duì)組織特異性的，或者可以通過(guò)敲除產(chǎn)生。