細(xì)胞破碎及超聲波細(xì)胞破碎儀應(yīng)用

細(xì)胞破碎是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)，是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。結(jié)合重組DNA技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)上的重大進(jìn)展，以前認(rèn)為很難獲得的蛋白質(zhì)現(xiàn)在可以大規(guī)模生產(chǎn)。

但是由于細(xì)菌、酵母、真菌、植物細(xì)胞壁的組成成分不同，且同類細(xì)胞結(jié)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也不同，所以其細(xì)胞壁的堅(jiān)固程度不同。而動物細(xì)胞雖沒有細(xì)胞壁，但具有細(xì)胞膜，也需要一定的細(xì)胞破碎方法來破膜，達(dá)到提取產(chǎn)物的目的。

一、細(xì)胞破碎方法

1. 機(jī)械法

1.1 組織搗碎

將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加速至所需速度。一般用于動物組織、植物肉質(zhì)種子、柔嫩的葉芽等，轉(zhuǎn)速可高達(dá)10000rpm/M以上。由于旋轉(zhuǎn)刀片的機(jī)械切力很大,制備一些較大分子如核酸則很少使用。

1.2 勻漿器

先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細(xì)胞研碎。勻漿器的研缽磨球和玻璃管內(nèi)壁之間間隙保持在十分之幾毫米距離。制作勻漿器的材料，除玻璃外，還可以用硬質(zhì)塑料、不銹鋼、人造熒光樹脂等。

此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動物臟器組織。

存在的問題：較易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性首以及有些亞細(xì)胞器，質(zhì)地堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥，也不適合用該法處理。

1.3 研缽

多用于細(xì)菌或其他堅(jiān)硬植物材料，研磨時常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨劑，以提高研磨效果。

1.4 細(xì)菌磨

是一種改良了的研磨器，比研缽具有更大的研磨面積，而且低部有出口。操作時先把細(xì)菌和研磨粉調(diào)成糊狀，每次加入一小勺，研磨20-30秒即可將細(xì)菌細(xì)胞完全磨碎。

2. 化學(xué)及生物化學(xué)法

2.1自溶法

在一定PH和適當(dāng)?shù)臏囟认�，利用組織細(xì)胞內(nèi)自身的酶系統(tǒng)將細(xì)胞破碎的方法。此過程需較長時間，常用少量防腐劑如甲苯、氯仿等防止細(xì)胞的污染。

2.2 酶溶法

利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶、半纖維素酶、脂酶等，將細(xì)胞壁分解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。有些細(xì)菌對溶菌酶不敏感，加入少量巰基試劑或8摩爾尿素處理后，使之轉(zhuǎn)為對溶菌酶敏感而溶解。

2.3 化學(xué)滲透法

某些有機(jī)溶劑（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性劑、金屬螯合劑、變性劑等化學(xué)藥品都可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性從而使內(nèi)合物有選擇地滲透出來。其作用機(jī)理；化學(xué)滲透取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁和膜的結(jié)構(gòu)與組成。

3. 物理法

3.1 反復(fù)凍溶法

原理：因突然冷凍，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成及胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細(xì)胞。

方法：將待破碎的細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。

3.3  急熱驟冷法

將材料投入沸水中，維持85-90分鐘，至水浴中急速冷卻，此法可用于細(xì)菌及病毒材料。

二、超聲波破碎機(jī)理

超聲波是物質(zhì)介質(zhì)中的一種彈性機(jī)械波，它是一種波動形式，因此它可以用于探測人體的生理及病理信息，既診斷超聲。同時，它又是一種能量形式，當(dāng)達(dá)到一定劑量的超聲在生物體內(nèi)傳播時，通過它們之間的相互作用,能引起生物體的功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即超聲生物效應(yīng)。

超聲對細(xì)胞的作用主要有熱效應(yīng)，空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)。

熱效應(yīng)是當(dāng)超聲在介質(zhì)中傳播時，摩擦力阻礙了由超聲引起的分子震動，使部分能量轉(zhuǎn)化為局部高熱（42-43℃），因?yàn)檎�常組織的臨界致死溫度為45.7℃，而腫瘤組織比正常組織敏感性高，故在此溫度下腫瘤細(xì)胞的代謝發(fā)生障礙，DNA、RNA、蛋白質(zhì)合成受到影響，從而殺傷癌細(xì)胞而正常組織不受影響。

空化效應(yīng)是在超聲照射下，生物體內(nèi)形成空泡，隨著空泡震動和其猛烈的聚爆而產(chǎn)生出機(jī)械剪切壓力和動蕩，使腫瘤出血、組織瓦解以致壞死。另外，空化泡破裂時產(chǎn)生瞬時高溫（約5000℃）、高壓（可達(dá)500×104Pa），可使水蒸氣熱解離產(chǎn)生.OH自由基和.H原子，由.OH自由基和.H原子引起的氧化還原反應(yīng)可導(dǎo)致多聚物降解、酶失活、脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞殺傷。

機(jī)械效應(yīng)是超聲的原發(fā)效應(yīng)，超聲波在傳播過程中介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)交替地壓縮與伸張構(gòu)成了壓力變化，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷。殺傷作用的強(qiáng)弱與超聲的頻率和強(qiáng)度密切相關(guān)。

三、超聲波應(yīng)用

1、超聲波提取生物納米(超聲波化學(xué)合成法)

超聲波化學(xué)反應(yīng)中，起關(guān)鍵作用的是聲波的空化效應(yīng)，在超聲波的輻照過程中，在液體里將發(fā)生空化氣泡的形成，長大和崩滅，當(dāng)空化氣泡崩滅時產(chǎn)生一個覆蓋著的強(qiáng)壓力脈沖，產(chǎn)生許多獨(dú)特的性質(zhì)，例如產(chǎn)生高達(dá)5000K的高溫，大于200Mpa的壓力，這就是超聲波化學(xué)合成的能量來源，利用這些能量能在一些特殊粉末表面合成出納米粒子。
  
2、超聲波制藥
   
2.1注射用醫(yī)藥物質(zhì)的分散

將磷脂類與膽固醇混合用適當(dāng)方法與藥物混合在水液中，經(jīng)超聲分散，可以得到更小粒子供靜脈注射。
    
2.2草藥提取

利用超聲分散破壞植物組織，加速溶劑穿透組織作用，提高中草藥有效成分提取率。如金雞納樹皮中全部生物堿用一般方法侵出需5小時以上，采用超聲分散只要半小時即可完成。
    
2.3制備混懸劑

在超聲空化和強(qiáng)烈攪拌下，將一種固體藥物分散在含有表面活性劑的水溶液中，可以形成1um左右口服或靜脈注射混懸劑。例“靜注喜樹堿混懸劑”“肝臟造影劑”、“硫酸鋇混懸劑”。
    
2.4 制備疫苗

將細(xì)胞或病菌借助于超聲分散將其殺死以后，再用適當(dāng)方法制成疫苗。

3、超聲波對化妝品的分散
    
為了更進(jìn)一步提取藥物精華和粒子微細(xì)化，并節(jié)約生產(chǎn)成本，達(dá)到分散、乳化效果，使化妝品更深入滲透到肌膚里層，讓肌膚很好的吸收，發(fā)揮藥物的效力和作用，采用超聲波乳化可達(dá)到非常理想的效果。采用超聲分散，則不需要使用乳化劑，就能使蠟及石蠟乳化、化妝水等油的微粒子分散。石臘在水中分散的粒子直徑可達(dá)1um以下。

4、超聲波對酒的醇化—催陳技術(shù)
    
一瓶美酒以它的酒味醇厚，綿軟柔和、芳香濃郁為人青睞，人們常用陳年老酒來形容酒的珍貴，一瓶上世紀(jì)的陳酒，標(biāo)價幾萬元，其價格的含義在于時間的存放上。酒的主要控制因素是化學(xué)變化即酸的形成，并進(jìn)一步酯化，酯參與乙醇和水的締合。剛出廠的酒含有戍醇，有辛辣味，這種氣味要經(jīng)過很長時間才能化解，這個緩慢變化稱酒的醇化。用功率1.6KW，頻率17.5-22KHZ的超聲波處理5-10min，可使酒的老熟時間縮短1/3到1/2。

四、超聲波破碎技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

就目前超聲波儀器主要有超聲波振蕩器以及超聲波粉碎儀等。

其優(yōu)點(diǎn)是保持細(xì)胞活性，省時，樣品損失少，可以處理大量樣品。因此超聲波細(xì)胞粉碎儀的不斷發(fā)展和改進(jìn)，對大規(guī)模生產(chǎn)的貢獻(xiàn)是十分可觀的。 超聲波細(xì)胞粉碎儀進(jìn)行超聲粉碎破碎是目前在生物生產(chǎn)中最常用的破碎方法。對不同菌種的發(fā)酵液。超聲破碎的效果差別較大。一般地，桿菌比球菌較易破碎，革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞比革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞較易破碎，對酵母菌的效果較差。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，液量損失少，適合實(shí)驗(yàn)室規(guī)模。缺點(diǎn)：成本高；易引起溫度的劇烈上升；在大規(guī)模操作中，聲能傳遞和散熱困難，產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)易使產(chǎn)物失活，所以其影響了其在大規(guī)模的工業(yè)上的應(yīng)用。

五、總結(jié)
  
超聲波細(xì)胞粉碎儀可以并且已經(jīng)被廣泛用于生物化學(xué)、微生物學(xué)藥理學(xué)、物理學(xué)、動物學(xué)、農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)、制藥等領(lǐng)域的教學(xué)、科研、生產(chǎn)
    
超聲波破碎作為細(xì)胞破碎的一種方法在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模應(yīng)用較普遍，處理少量樣品時操作簡便，液量損失少，但是超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活。而且大容量裝置聲能傳遞，散熱均有困難，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。從前面可以看出超聲波破碎細(xì)胞技術(shù)遠(yuǎn)未完善，還有待進(jìn)一步發(fā)展。