腫瘤免疫和Car-T臨床前研究中如何選擇正確的小鼠模型

腫瘤免疫治療大概是目前最火熱的創(chuàng)業(yè)和投資領(lǐng)域了，尤其是腫瘤免疫抗體藥物和Car-T治療領(lǐng)域。對于一個創(chuàng)新藥物，需要經(jīng)過一系列的臨床前和臨床試驗，以證明其“有效”和“安全”，才能被批準上市并進入醫(yī)生的處方里，當然腫瘤免疫抗體藥物和Car-T也不例外。新藥臨床試驗不管是成功還是失敗，都是一項花費巨大的工程，這就需要我們盡可能全面地通過臨床前試驗來對這些新藥進行仔細的評價，以提高臨床成功率。找到最合適的動物模型，往往可以給我們提供最可靠的數(shù)據(jù)。那么，在腫瘤免疫抗體藥物和Car-T這種新型藥物研發(fā)中，應(yīng)該如何選擇動物模型呢？

在選擇體內(nèi)藥效評價模型方面，小鼠無疑是最常用的動物模型。首先，小鼠的繁殖快，可以快速得到有統(tǒng)計學(xué)意義的同周齡、同性別、且足量的小鼠；第二，有足夠多的近交系小鼠腫瘤細胞系可以使用；第三，容易建立較穩(wěn)定的動物－腫瘤模型體系，建立標準化的藥效評價平臺。

然而，通過對比小鼠和人基因序列發(fā)現(xiàn)，普通小鼠的很多基因與對應(yīng)的人類基因之間，在蛋白氨基酸序列上的同源性經(jīng)常不是足夠高。所以，一般情況下，識別人蛋白的抗體，并不識別小鼠相應(yīng)基因蛋白。也就是說，我們一般不能用普通小鼠來評價抗人蛋白抗體的藥效。這就需要對小鼠的基因進行人源化改造。比如，以免疫檢查點PD-1為例，將小鼠的PD1基因換成人的PD-1基因，所得到的PD-1人源化小鼠就可以用來做anti-human PD1抗體的藥效評價。除了PD-1以外，百奧賽圖基本完成了所有小鼠免疫檢查點的人源化改造、進行了藥效驗證、并實現(xiàn)了規(guī)�；�供應(yīng)。這些小鼠將助力國內(nèi)外腫瘤免疫抗體藥物的研發(fā)。

這種基因編輯人源化小鼠模型的優(yōu)勢是，因為小鼠本身的免疫系統(tǒng)是完整的，非常適合針對同一靶點的不同單克隆抗體之間藥效和毒性的精確比較。在R&D階段找到藥效最好、安全性最好的候選抗體，會提高最終抗體成藥的成功率。

然而，畢竟人源化小鼠從制備、繁殖、鑒定、評價、到成為藥效驗證的平臺需要超過2年的時間，不是所有靶點都能有現(xiàn)成的基因編輯人源化小鼠。而且，有的研究者認為，通過人免疫系統(tǒng)重建之后的小鼠，也許跟人體真實情況更接近一些。利用重度免疫缺陷小鼠（如JAX的NSG，百奧賽圖的B-NDG小鼠等）進行免疫重建，也是一種可行的替代方案。

一種方法是將人的外周血單核細胞(PBMC)直接注射到重度免疫缺陷小鼠里進行免疫重建，其優(yōu)勢在于PBMC已經(jīng)是人體內(nèi)發(fā)育成熟的免疫細胞。但由于PBMC的T細胞受體注射到小鼠體內(nèi)后，會非特異地識別小鼠的MHC，導(dǎo)致人T細胞（尤其是CD8+ T細胞）在小鼠體內(nèi)大量增殖，分泌大量的細胞因子，最終引起GvHD（移植物抗宿主反應(yīng)），5-6周內(nèi)導(dǎo)致小鼠體重下降和死亡。如果在這種免疫重建的小鼠里接入腫瘤，由于體內(nèi)大量活化的T細胞和細胞因子的存在，將使腫瘤免疫藥效試驗的結(jié)果非常復(fù)雜和不穩(wěn)定，雖然可以做一些定性試驗，但很難精確比較不同抗體的藥效和安全性。   

另一種方法是從臍帶血中分離CD34+成血干細胞，注射到經(jīng)過輻照或新生的重度免疫缺陷小鼠里。經(jīng)過3-4個月的體內(nèi)細胞發(fā)育分化，會得到人的免疫細胞。因為這種小鼠沒有人T細胞發(fā)育所必需的人的胸腺，所以得到的免疫細胞免疫功能是有缺陷的，其體液免疫（B細胞免疫）也是有缺陷的。不過，這種方式得到的小鼠可以在一定程度上滿足腫瘤免疫藥物研發(fā)的需求，雖然實驗結(jié)果不穩(wěn)定，批間差比較大。

更復(fù)雜的方式是同時移植胎兒胸腺、胎肝和骨髓組織（即BLT模型），但是這種方法的制備成本太高，也很難批量制備，所以，只適合于科學(xué)研究，卻不能滿足藥物研發(fā)所要求的大批量、穩(wěn)定和可重復(fù)的要求。

近幾年，NSG和B-NDG這樣的重度免疫缺陷小鼠也廣泛用于Car-T的藥效評價，也獲得了不錯的結(jié)果，尤其是針對B細胞淋巴瘤的Car-T試驗。然而，雖然我們看到了B細胞淋巴瘤被Car-T細胞清除了，從免疫學(xué)的基本知識可以知道，Car-T在小鼠體內(nèi)的行為方式跟人體內(nèi)是不同的。

Car-T的制備過程是將患者自身T細胞進行體外激活并轉(zhuǎn)染表達抗原（比如CD19, BCMA等）特異性抗體基因，然后再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。也就是說，Car-T帶有兩種受體，即TCR和BCR（抗體）。做為自身T細胞，在沒有抗原刺激的情況下，Car-T回輸后在人體內(nèi)是不會擴增的（在忽略體外T細胞激活導(dǎo)致的瞬時體內(nèi)增殖情況下），Car-T在體內(nèi)擴增的動力主要是來源于Car-T上的抗體跟抗原的結(jié)合。在腫瘤細胞被清楚后，Car-T細胞群會迅速萎縮，或許留下一小部分Car-T記憶細胞。

然而，在免疫缺陷小鼠體內(nèi)，與PBMC相似，Car-T會通過其TCR被小鼠的MHC激活，造成Car-T的大量非特異性擴增，以及釋放大量細胞因子。即使腫瘤細胞被Car-T清除之后，Car-T也不會像在人體內(nèi)一樣快速萎縮，而是會跟PBMC一樣，繼續(xù)增殖，從而導(dǎo)致GVHD。尤其在實體瘤研究方面，我們并不希望Car-T在小鼠體內(nèi)大量非特異地增殖，從而影響實驗結(jié)果的判斷。因為在小鼠內(nèi)，Car-T的激活和擴增并不主要是由腫瘤抗原推動的。了解所用的小鼠并找到好的模型將會讓我們更好的評價Car-T的藥效以及安全性。

那有沒有更好的模型呢？理論上，MHC缺失的免疫缺陷小鼠會更好一些。如果將PBMC注射到MHC缺失的小鼠里，PBMC里的T細胞因為不會被小鼠MHC非特異刺激，也就不會瘋狂地增殖，從而將GVHD的發(fā)生時間很大程度的延遲。如果將PBMC和人的腫瘤接種到MHC缺失的重度免疫缺陷小鼠里，將會給研究者更長的實驗窗口期，更好的模擬人體內(nèi)的抗腫瘤免疫反應(yīng)并進行藥效研究。因為PBMC比臍帶血CD34＋細胞更容易獲得，也將極大地提高制備效率和產(chǎn)能，滿足醫(yī)藥研發(fā)所要求的大批量、穩(wěn)定和可重復(fù)。

至少在MHC class I 缺失（b2m敲除）的B-NDG-b2m小鼠里，我們可以看到，接種PBMC和人腫瘤后，如果進行腫瘤免疫抗體藥物處理，會觀察到腫瘤被抑制，同時在可觀察的時間窗口內(nèi)，沒有見到體重下降（GVHD)。所以，在B-NDG-b2m小鼠里植入人腫瘤細胞，并注射人PBMC模型，所制備的模型可以更好的進行腫瘤免疫藥物的藥效評價。與臍帶血CD34+細胞重建模型不同，PBMC重建小鼠里的免疫細胞功能是完善的，而且還極大地縮短了模型制備時間。

B-NDG-b2m小鼠也非常適合于Car-T的藥效研究。將人腫瘤細胞注射到小鼠體內(nèi)，4天后給小鼠注射Car-T，可以看到腫瘤細胞被清除，同時，也可以看到血液中Car-T細胞數(shù)量的激增，然后隨著腫瘤細胞的清除伴隨血液中Car-T數(shù)量的下降。這說明Car-T細胞在MHC敲除小鼠里不會非特異地大規(guī)模增殖，更真實地模擬了人體內(nèi)Car-T的作用方式。這對于研究Car-T的安全性也具有更好的指導(dǎo)意義。

我相信隨著新模型的不斷涌現(xiàn)，會找到更好的用于腫瘤免疫抗體和Car-T藥效評價的人免疫系統(tǒng)重建小鼠模型。百奧賽圖一直在不斷地開發(fā)、優(yōu)化新的模型。