CRISPR/Cas9技術(shù)，熱度背后的冷思考

近年來(lái)，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)正在給整個(gè)科研界帶來(lái)革命性變化，該技術(shù)使用CRISPR系統(tǒng)將Cas9蛋白和向?qū)�RNA注入小鼠受精卵，就能輕松實(shí)現(xiàn)基因敲除，同時(shí)，注入Donor DNA則可實(shí)現(xiàn)基因敲入，甚至國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊Genome Biology有文章指出這項(xiàng)新技術(shù)將很快取代使用胚胎干細(xì)胞的基因修飾，看起來(lái)小鼠胚胎干細(xì)胞基因修飾技術(shù)的終結(jié)不可避免。

然而，事實(shí)是這樣嗎？

脫靶效應(yīng)仍存爭(zhēng)議

CRISPR/Cas9這一被稱為“魔剪”的基因編輯工具在基因工程應(yīng)用方面被寄予厚望。但是，脫靶效應(yīng)這一有爭(zhēng)議的老問(wèn)題一直影響著CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用。有文獻(xiàn)報(bào)道，CRISPR/Cas9的切割是通過(guò)gRNA與基因組位置之間20bp堿基的配對(duì)，且配對(duì)堿基的 5′ 端需要有PAM結(jié)構(gòu)，再引導(dǎo)Cas9作用實(shí)現(xiàn)的，但是CRISPR/Cas9與靶位點(diǎn)識(shí)別的特異性主要依賴于gRNA與靠近PAM處10-12bp堿基的配對(duì)，而其余遠(yuǎn)離PAM處8-10bp堿基的錯(cuò)配對(duì)靶位點(diǎn)的識(shí)別影響不明顯，這項(xiàng)研究直接說(shuō)明了CRISPR/Cas9存在嚴(yán)重的脫靶性，即該技術(shù)可以發(fā)生非特異性切割，引起基因組非靶向位點(diǎn)的突變，這樣會(huì)造成研究結(jié)果的不確定性。

去年在Nature Methods雜志上發(fā)表的研究“Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo”通過(guò)全基因組測(cè)序分析表明CRISPR基因編輯會(huì)引入數(shù)百種不可預(yù)估的突變到基因組中，文章所指出的大規(guī)模脫靶問(wèn)題，對(duì)CRISPR的應(yīng)用提出了尖銳的挑戰(zhàn)，卻又在今年3月30日出現(xiàn)反轉(zhuǎn)并進(jìn)行了撤稿處理。值得注意的是，這篇文章的第一作者Kellie A Schaefer和共同第一作者Wen-Hsuan Wu均同意撤稿，而包括通訊作者Alexander G Bassuk以及Vinit B Mahajan在內(nèi)的其余四位作者則不同意撤稿。這與通常的撤稿情況還是有所不同，一般的撤稿大多數(shù)情況貌似都是通訊作者要撤稿，這篇爭(zhēng)議性文章通訊作者則堅(jiān)持了自己的意見。顯然，這篇文章在研究者們內(nèi)部也有巨大分歧。

不過(guò)，也有研究表明，CRISPR的脫靶問(wèn)題并沒(méi)那么嚴(yán)重：bioRxiv期刊上的研究“Whole genome sequencing of multiple CRISPR-edited mouse lines suggests no excess mutations.”指出，多個(gè)采用CRISPR/Cas9技術(shù)基因編輯的小鼠品系經(jīng)過(guò)全基因組測(cè)序后的結(jié)果顯示，CRISPR/Cas9技術(shù)可在生物水平上精準(zhǔn)地對(duì)基因組進(jìn)行編輯，并沒(méi)有引入很多非預(yù)期的脫靶突變。

從以上這些充滿爭(zhēng)議性的研究可以看出，在應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)時(shí)，其脫靶效應(yīng)仍需謹(jǐn)慎考慮。綜合來(lái)看，現(xiàn)階段修飾準(zhǔn)確、效果穩(wěn)定、脫靶率極低的ES打靶技術(shù)仍是研究者的較優(yōu)選擇。

CRISPR/Cas9技術(shù)目前難以勝任復(fù)雜的基因編輯

另一方面，對(duì)于復(fù)雜的基因修飾（如條件性敲除、條件性點(diǎn)突變和大片段敲入等），CRISPR有先天不足，因?yàn)榇藭r(shí)需要Donor DNA與受精卵中基因組的特定位置發(fā)生同源重組，而同源重組的效率很低。相反，ES打靶技術(shù)在這一方面因其flox區(qū)域范圍大、對(duì)于復(fù)雜結(jié)構(gòu)寬容度高、打靶一次成功率高等特點(diǎn)，會(huì)有明顯的優(yōu)勢(shì)。

CRISPR/Cas9專利之爭(zhēng)仍存爭(zhēng)議，商業(yè)化應(yīng)用存在較大隱患

對(duì)于CRISPR/Cas9技術(shù)，還有一個(gè)值得關(guān)注的是其專利使用問(wèn)題，CRISPR/Cas9專利是基于多家機(jī)構(gòu)的研究成果，產(chǎn)權(quán)不明晰，一直存在所有權(quán)之爭(zhēng)。

2017年初，Broad研究所和合作者們被授權(quán)了關(guān)于真核生物細(xì)胞（包括人類細(xì)胞）的基因組編輯的CRISPR專利，而加州大學(xué)伯克利分校和合作者授權(quán)的專利是關(guān)于將CRISPR技術(shù)用于到cell-free系統(tǒng)中，并不是涉及真核細(xì)胞的基因組編輯。然而，后者對(duì)這一判決結(jié)果并不滿意，不滿意的結(jié)果就是啟動(dòng)專利抵觸程序（interference proceeding）。通過(guò)該程序一個(gè)發(fā)明者可以接手另一個(gè)發(fā)明者的專利。

來(lái)自咨詢公司IPStudies2017年的數(shù)據(jù)顯示，目前還有763項(xiàng)和Cas9相關(guān)的專利，在這些專利中，有些聲稱擁有某些CRISPR/Cas9基因編輯方面的專利權(quán)，隨著時(shí)間過(guò)去，這些專利的擁有者或許也會(huì)試圖去維護(hù)他們的權(quán)利。

CRISPR專利的紛爭(zhēng)給一些商業(yè)機(jī)構(gòu)帶來(lái)了巨大的困惑。 首先，這意味著在未獲得CRISPR/Cas9技術(shù)專利授權(quán)的商業(yè)機(jī)構(gòu)購(gòu)買基于CRISPR/Cas9技術(shù)提供的技術(shù)服務(wù)和產(chǎn)品，存在著較大的法律風(fēng)險(xiǎn)；其次，很難保證從一家專利所有人購(gòu)買的專利能覆蓋所有應(yīng)用需求。

應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)表的文章數(shù)量和質(zhì)量低于ES打靶技術(shù)發(fā)表的文章

通過(guò)Google學(xué)術(shù)搜索2013年至今有關(guān)CRISPR/Cas9基因敲除和ES打靶技術(shù)有關(guān)的文章，搜索knockout “embryonic stem cell” or “ES cell” 找到約17300條結(jié)果，搜索knockout “crispr” or “cas9” 找到約16100條結(jié)果。

針對(duì)兩個(gè)搜索結(jié)果，隨機(jī)抽檢搜索列表中的100篇文獻(xiàn)，統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)采用ES打靶技術(shù)發(fā)表的文章平均影響因子比CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)表的文章高2.1 IF。因此，不論從文章質(zhì)量還是數(shù)量，目前CRISPR/Cas9技術(shù)的影響力仍弱于金標(biāo)準(zhǔn)的ES打靶技術(shù)。不過(guò)不可因此否認(rèn)CRISPR/Cas9技術(shù)未來(lái)潛在的影響力。

綜合以上幾個(gè)方面來(lái)看， 近年來(lái)一直處于風(fēng)口浪尖的熱點(diǎn)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)過(guò)多次類似的“危機(jī)”，雖然有很多優(yōu)勢(shì)，但學(xué)界仍需對(duì)其保持冷靜態(tài)度，隨著不同國(guó)家、不同地域的研究者們?cè)贑RISPR領(lǐng)域孜孜探索，也許這次一系列事件對(duì)CRISPR來(lái)說(shuō)并非危機(jī)，反而是推動(dòng)其發(fā)展的重要力量，我們也希望科學(xué)家們可以不斷去探索，優(yōu)化工藝，以期將基因組編輯技術(shù)被更廣泛應(yīng)用于臨床的疾病治療。

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