想洞悉細胞線粒體內部精細結構？全新SIM超分辨技術有話講！
生物圈的小伙伴肯定還記得前段時間的一則刷屏新聞：
北京大學陳良怡教授團隊和華中科技大學譚山教授團隊合作，成功發(fā)明了一種新型結構光照明超分辨顯微成像技術——海森結構光照明顯微鏡。研究成果于高水平學術期刊Nature Biotechnology（IF=41.67）進行了發(fā)表。
之所以轟動，是因為該技術擁有超高的采集速度和靈敏度，以及低于共聚焦和其他超分辨成像方法（STORM/STED等）千分之一以上的光毒性和光漂白效應，成為了目前進行超長時間活細胞高速超分辨成像的利器。
而且，這個牛氣哄哄的技術一經發(fā)明，便已經奪得生物成像領域的好幾個“首次”：
· 首次在活體細胞中清晰解析出線粒體的內膜結構，以及線粒體融合與裂解過程中內膜的動態(tài)變化；
· 首次觀察到活體細胞中線粒體嵴與內質網之間的相互作用與運動；
· 首次通過連續(xù)成像的形式，捕捉到了完整的囊泡分泌與融合過程中的孔道及融合中間態(tài)。
那么究竟這臺高大上儀器是怎樣被研發(fā)而出？它爆炸性的技能點具體又是怎樣？接下來我們就來深度解讀一下啦！
實時觀察線粒體融合分裂及內膜動態(tài)變化
從1994年Stefen W. Hell提出STED顯微鏡理論，到2014年三位科學家因為超分辨顯微技術獲得諾貝爾化學獎。短短20年間，超分辨成像可以說是聲名大噪，各種超分辨成像平臺也幾乎成為了各大高校研究所的必備。
但是，一個奇怪的現象讓北京大學的陳良怡教授產生了疑惑：雖然遍地開花，但由超分辨成像技術所帶來的生物學新發(fā)現卻屈指可數。究竟是何種原因，限制了超分辨顯微成像在生物研究領域大顯身手？
目前，主流的超分辨成像技術主要有三類：
1、基于可隨機開關的單分子熒光閃爍定位的STORM/PALM方法；
2、基于熒光蛋白受激發(fā)射損耗原理的STED方法；
3、基于結構光調制與解調制圖像信息的SIM方法。
其中，STED通過純光學方法能夠獲得50 nm甚至更低的分辨率，不通過算法擬合重建，成像速率取決于共聚焦平臺的振鏡掃描速率。但是其明顯的弊端在于用于激發(fā)樣品的光功率是最強的（MW/cm2數量級，相當于100萬個太陽同時在天上炙烤你的皮膚）。如此一來，既會對樣品產生積累的光毒性，又容易在長時間的活細胞觀察過程中使樣品熒光淬滅。
STORM/PALM相對于STED來說光照條件要稍微溫和一些（kW/cm2數量級，大概也就相當于1000個太陽吧），分辨率也能到50 nm以下。但由于獲得一張超分辨圖片需要基于成百上千張原始的單分子閃爍圖像，并通過算法擬合重建。所以成像的速度也是制約其發(fā)展的重要原因。同時，STORM/PALM對于熒光標記物的選擇是非常苛刻的，因此幾乎不能在同一個樣品上實現多個蛋白的超分辨觀察。
但是另外一種超分辨率方法，基于莫爾條紋效應的SIM就不一樣了！
基于傅里葉光學和算法重建，SIM能夠用最低的光功率（W/cm2數量級）獲得長時間的活細胞超分辨圖像。同時它對熒光標記物也無選擇性，可以輕松實現多標記物觀察。最重要的是由于重建一張超分辨圖像只需要9-15張原始圖像，因此SIM也是在相同成像視野下最快的超分辨方法。該方法非常適合生物樣品中快速生物學過程的記錄，如細胞內膜系統(tǒng)和細胞骨架的動態(tài)學研究、離子成像以及神經放電等等。
不過SIM也有一個明顯的劣勢——只能達到100 nm左右的分辨率。雖然使用非線性SIM成像可以使分辨率媲美其他兩種方法，但代價則是需要使用很強的激發(fā)光，失去了活細胞觀察的優(yōu)勢。
看準了SIM成像的優(yōu)勢，陳教授團隊便開始著手進行線性SIM方法的優(yōu)化。為了達到88 nm，188 Hz的優(yōu)良性能，他們主要在以下幾個方面做出了努力：
1、使用高NA的物鏡，提升極限分辨率，盡可能多的接收光信號
提升成像系統(tǒng)的NA值一直是提高系統(tǒng)分辨率的不二法門。通過使用NA值高達1.7的油鏡，再加上SIM方法本身的2倍分辨率提升，Hessian-SIM系統(tǒng)的最佳分辨率可以達到88 nm。
使用更高數值孔徑的物鏡可以明顯提升光學系統(tǒng)的OTF,使其在傅里葉頻域空間能探測更高頻的信號。在二維的頻域空間中，越靠近中央亮點的區(qū)域，代表圖像越低頻的部分，可以看到NA值越高越能覆蓋到邊緣的高頻區(qū)域。
同時，NA值越大的物鏡接受光信號的能力也越大，這樣就可以最大限度降低激發(fā)光功率，或者使用盡可能短的曝光時間以期達到高速成像的目的。
2、改良了傳統(tǒng)SIM方法產生衍射光柵的方法
2D-SIM成像需要通過產生兩束互相干涉的光來形成三種不同偏振方向，且光強在空間上呈正弦變化的結構光。在傳統(tǒng)的SIM成像方法中，這一過程除了要依靠液晶硅基的空間光調制器（LCOS-SLM）對光相位進行調制之外，還需要一種特殊的光學器件來改變光的偏振方向——旋偏器（polarization rotator）。但這個器件本身的響應時間是ms數量級的，所以成為了高速SIM成像的一個限制因素。
而陳教授團隊自主設計了新的偏振旋轉玻片陣列，使其可以更好的配合SLM和相機曝光，使得激發(fā)光的偏振方向做最快速的切換。
圖中PR所示部分即旋偏器，b中上下兩部分的雙向箭頭分別表示入射光和經過旋偏器后光的偏振方向。
3、極大程度的降低圖像采集和重構過程中產生的Artifact
我們都知道在SIM方法中，算法重建也起著相當重要的作用。但是在解卷積的算法中，計算機或者說軟件對信號和噪音的解讀是“一視同仁”的。換句話說它很難自己告訴自己哪些地方是信號，哪些地方是噪聲。
所以，為了將SIM成像的低光漂泊和光毒性優(yōu)點發(fā)揮到極致，不得不克服在弱光低信噪比情況下算法所重建出來的Artifact。為了應對相應的問題，譚山教授團隊提出了一種能夠基于生物樣品結構相關的先驗知識來屏蔽噪音信號的重建算法——Hessian解卷積算法。
這個就是Hessian解卷積算法的最優(yōu)解形式，以及其中的Hessian罰分矩陣（別問，小編也不懂̷̷扶額.jpg）
我們知道，樣品信號除了在xy平面上具有連續(xù)結構之外，當其每一幀的運動距離小于系統(tǒng)空間分辨率時，它在xyt的時空上也是連續(xù)的。相反，背景噪聲在重建后形成的Artifact則是時空分布隨機和無特定形態(tài)的，因此通過這一標準就可以很好的去除這些Artifact。
通過比較Hessian解卷積算法和其他幾種經典和常見的SIM重構算法（如Wiener、TV-SIM、fairSIM等），發(fā)現高速記錄時的低信噪比圖像在使用除Hessian之外的算法進行重構之后，均會有不同程度的Artifact產生（同樣的情況在長時間激發(fā)引起的光漂泊現象中也能夠觀察到），而Hessian算法的表現則一如既往的好。
不同SIM解卷積算法重建超分辨圖像的效果對比：樣品為Lifeact-EGFP標記的微絲，曝光時間為0.5 ms，每組左圖為0 s時刻的圖像，右圖為60 s時刻的圖像。
此外，該系統(tǒng)也擁有超高的時間分辨率，并達到了188 Hz的幀速。有著這樣的性能表現，其關鍵硬件——相機則應實現9倍以上的采集速度。
使用了第二代前照式sCMOS芯片，可在512×100的分辨率下進行2000幀/s的采集——作為目前科研領域最高速的CMOS相機，濱松sCMOS ORCA-Flash4.0 V3便是該系統(tǒng)的選擇。
雖然使用前照式芯片是保證成像速率的必要之舉，但是也并沒在靈敏度上大打折扣。濱松Flash4.0相機具有業(yè)內最低的讀出噪音(0.8 e-)，同時82%的高量子效率，可保證在低曝光時間的條件下得到相對高的圖像信噪比。
針對現在流行的超分辨成像技術，其相機芯片也做了更加精細的定量校準，將像素之間的光響應差異(PRNU)和噪音的不均一性(DSNU)都降到最低。
值得一提的是，Flash4.0輸出的圖像一直以來都是未經任何處理的原始圖像，不在原始數據層面對噪音或hotpixel進行插值或濾波。這樣在輸入到各種重建或擬合的算法模型中才能得到準確的結果，避免了再人為引入其他Artifacts。
通過硬件創(chuàng)新和算法優(yōu)化以及精確的時空信號控制，Hessian-SIM可以在低于傳統(tǒng)SIM激發(fā)光功率的條件下，以更低的曝光時間進行圖像采集，并對樣品的原始信息高度還原。從而實現對細胞內瞬時變化的高速連續(xù)記錄，或者對活細胞內部結構的長時觀察。
在相同的光照條件下，以1 Hz頻率進行拍攝1 h，傳統(tǒng)SIM使用7 ms曝光，而Hessian-SIM使用0.5 ms曝光。
陳良怡教授團隊一直致力于對高端的生物成像技術進行革新性的改良和研發(fā)。除了解決超分辨成像的長時間或高速問題之外，早在2014年就與程和平院士就將雙光子和光片成像技術結合開發(fā)出激發(fā)光片范圍更大同時z軸分辨率更高的成像技術（Zong W, Chen L, et al.CellRes. 2014 Sep 26. doi: 10.1038/cr.2014.124）；2017年又針對雙光子在神經生物學應用中的靈活性，開發(fā)出了現今質量最小的頭戴式微型雙光子顯微鏡（Zong W, Wu R, Li M, ChenL, et al. Nat Methods. 2017 May 29. doi: 10.1038/nmeth.4305），解決了行為學和活體顯微觀察的矛盾。
除了科研相機外，濱松的光電器件，如光電倍增管等，也參與到了這些重要研究中。以淬煉了60余年的光電探測技術，為發(fā)展更好的科研成像技術，貢獻出濱松的一份力量。
