細胞誘導型一氧化氮合成酶活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品使用說明書

主要用途

YIJI細胞誘導型巨噬細胞一氧化氮合成酶（iNOS /NOS2/mNOS）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過誘導型一氧化氮合成酶、硝酸還原酶和乳酸脫氫酶反應系統(tǒng)，在誘導型一氧化氮合成酶特異性抑制劑存在與否的情況下，由底物L-精氨酸被催化產(chǎn)生一氧化氮，再轉(zhuǎn)化為亞硝酸，然后使用Griess試劑，得到紫紅或粉紅色偶氮化合物產(chǎn)物，通過觀察其吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細胞樣品中誘導型一氧化氮合成酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解懸液樣品（動物、人體、昆蟲等）的誘導型一氧化氮合成酶的活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，重復性好。

技術(shù)背景

一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase；NOS；EC1.14.13.39）是鈣調(diào)蛋白（calmodulin）依賴性或含鈣調(diào)蛋白的細胞色素p450類血紅素蛋白（hemoprotein），分子量為130至160KD的二體蛋白，其催化結(jié)構(gòu)域包括還原酶、加氧酶、黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide；FAD）、核黃素單苷酸（flavin mononucleotide；FMN）等要素，在輔助因子四氫生物喋呤（tetrahydro-biopterin）的幫助下，進行非芳香類氨基酸L-精氨酸（L-arginine）的5’端電子氧化。一氧化氮合成酶催化L-精氨酸末端的氮原子，在還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）和氧氣的參與下，成為一氧化氮（nitric oxide）的合成反應。一氧化氮合成酶有三種異構(gòu)體：神經(jīng)元型（neuronal NOS；nNOS；NOS1）、內(nèi)皮細胞型（endothelial NOS；eNOS；NOS3）和巨噬細胞型（macrophage NOS；mNOS；NOS2），前二者為結(jié)構(gòu)型一氧化氮合成酶（constitutive NOS；cNOS），后者為誘導型一氧化氮合成酶（inducible NOS；iNOS）。iNOS屬于無鈣性，是在細胞因子如白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素-γ(IFN－γ)、內(nèi)毒素等誘導下由血管平滑肌細胞、巨噬細胞、心肌細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞及上皮細胞產(chǎn)生的。其作用產(chǎn)生的NO遠多于由cNOS作用產(chǎn)生的NO為多。誘導型一氧化氮合成酶與免疫反應、抵抗病源微生物等機制有關，尤其在敗血癥休克、自主免疫性疾病等發(fā)揮作用。基于底物L-精氨酸，在誘導型一氧化氮合成酶特異性抑制劑氨基胍（aminoquanidine）存在與否的情況下，以及NADPH和氧氣的參與下，由誘導型一氧化氮合成酶催化產(chǎn)生一氧化氮氣體和瓜氨酸（citrulline）；在液體中，一氧化氮迅速轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定且不揮發(fā)的硝酸和亞硝酸，進而使用硝酸還原酶（nitrate reductase；NaR），催化硝酸還原為亞硝酸的反應，然后通過格里斯試劑（Griess Reagent）氨苯磺胺（sulfanilamide）和N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽（N-(1-Naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride；NED），在酸性條件下的重氮化（diazotization）反應，產(chǎn)生紫紅或粉紅色的偶氮化合物（Azo compound），通過其吸收峰值的變化（540nm波長），同時使用乳酸脫氫酶系統(tǒng)去除多余NADPH對于格里斯反應的干擾，由此來定量分析誘導型一氧化氮合成酶的活性。其反應方式為： 

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A） 毫升

YIJI裂解液（Reagent B） 毫升

YIJI緩沖液（Reagent C） 毫升

YIJI反應液（Reagent D） 毫升

YIJI酶解液（Reagent E）  毫升

YIJI底物液（Reagent F）    毫升

YIJI顯色液（Reagent G）    毫升

YIJI標準液（Reagent H）  微升

YIJI專性液（Reagent I）       微升

產(chǎn)品說明書      1份

保存方式

保存YIJI反應液（Reagent D）、YIJI酶解液（Reagent E）和YIJI專性液（Reagent I）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；YIJI反應液（Reagent D）和YIJI顯色液（Reagent G）避免光照；有效保證6月

用戶自備

YIJI完全緩沖液（Reagent J）：用于檢測純化誘導型一氧化氮合成酶或體外檢測

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于制備樣品和標準品的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品處理

細胞刮脫棒：用于脫離貼壁細胞

恒溫水槽：用于反應孵育

96孔板或比色皿：用于比色的容器

酶標儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

實驗步驟

實驗開始前，設定好分光光度儀或酶標儀（溫度為25℃）：波長540nm，并置零。然后進行下列操作。

一、樣品準備

• 準備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心抽去培養(yǎng)液
• 小心加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升YIJI裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化（約80下）
• 將所有勻漿物移入2毫升離心管
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取1毫升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、標準樣品配制

• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到2至5號管
• 移取xx微升YIJI標準液（Reagent H）到1號管
• 小心移取xx微升1號管的YIJI標準液（Reagent H）到2號管，混勻
• 小心移取xx微升2號管稀釋的YIJI標準液（Reagent H）到3號管，混勻
• 小心移取xx微升3號管稀釋的YIJI標準液（Reagent H）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

• 標準曲線測定

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升上述配制的YIJI標準液（Reagent H）
• 加入xx微升YIJI反應液（Reagent D）
• 槍頭抽吸數(shù)次，混勻
• 室溫下孵育60分鐘
• 加入xx微升YIJI酶解液（Reagent E）
• 室溫下孵育20分鐘
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent G）
• 室溫下，孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
• 重復實驗步驟1至11四次
• 構(gòu)建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標（X軸）為標準一氧化氮濃度（微摩爾/升）

• 樣品總活性測定

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入40微升上述準備的待測樣品（注意：細胞裂解樣品為50微克蛋白）
• 加入xx微升YIJI反應液（Reagent D）
• 槍頭抽吸數(shù)次，混勻
• 室溫下孵育60分鐘 
• 加入xx微升YIJI酶解液（Reagent E）
• 室溫下孵育20分鐘
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent G）
• 室溫下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
• 根據(jù)標準曲線獲得樣品總活性對應一氧化氮濃度（微摩爾/升）
• 計算樣品酶總活性

• 樣品非特異活性測定

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI專性液（Reagent I）
• 加入40微升上述準備的待測樣品（注意：細胞裂解樣品為50微克蛋白）
• 加入xx微升YIJI反應液（Reagent D）
• 槍頭抽吸數(shù)次，混勻
• 室溫下孵育60分鐘 
• 加入xx微升YIJI酶解液（Reagent E）
• 室溫下孵育20分鐘
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent G）
• 室溫下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
• 根據(jù)標準曲線獲得樣品非特異活性對應一氧化氮濃度（微摩爾/升）
• 計算樣品酶非特異活性

• 計算樣品活性

• 酶標儀測定

• 樣品總活性測定

• 在96孔板上做好相應標記：標準樣品和待測樣品
• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到所有孔里
• 分別加入xx微升上述配制的YIJI標準液（Reagent H）或待測樣品（注意：細胞裂解樣品為50微克蛋白）到相應孔里
• 分別加入xx微升YIJI反應液（Reagent D）到所有孔里
• 輕輕搖動96孔板
• 室溫下孵育60分鐘 
• 加入xx微升YIJI酶解液（Reagent E）
• 室溫下孵育20分鐘
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）到所有孔里
• 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent G）到所有孔里
• 輕輕搖動96孔板
• 室溫下孵育10分鐘
• 即刻放進酶標儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
• 構(gòu)建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標（X軸）為標準一氧化氮濃度（微摩爾/升）
• 根據(jù)標準曲線獲得樣品總活性對應一氧化氮濃度（微摩爾/升）
• 計算樣品酶總活性

2）樣品非特異活性測定

• 在96孔板上做好相應標記：待測樣品
• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到相應孔里
• 加入xx微升YIJI專性液（Reagent I）
• 加入40微升待測樣品（注意：細胞裂解樣品為50微克蛋白）
• 加入xx微升YIJI反應液（Reagent D）
• 輕輕搖動96孔板
• 室溫下孵育60分鐘 
• 加入xx微升YIJI酶解液（Reagent E）
• 室溫下孵育20分鐘
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent G）
• 輕輕搖動96孔板
• 室溫下孵育10分鐘
• 即刻放進酶標儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
• 根據(jù)標準曲線獲得樣品非特異活性對應一氧化氮濃度（微摩爾/升）
• 計算樣品酶非特異活性

3）樣品特異活性計算

注意事項

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括標準樣品
• 操作時，須戴手套
• 本產(chǎn)品不適宜于純化或粗提誘導型一氧化氮合成酶樣品的檢測；如果需要檢測，建議另購使用YIJI完全緩沖液（Reagent J） 
• 樣品中避免含有各種還原性化學物質(zhì)，包括巰基乙醇（2－mercaptoethanol）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol；DTT）、維生素C（ascorbic acid）和疊氮化鈉（azide）等
• 如果用戶沒有540nm波長的濾波器，可以使用530至560nm之間的任一波長替代
• 避免使用胰酶脫離貼壁細胞
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/40微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以增加或減少甚至稀釋樣品量
• 誘導型一氧化氮合成酶單位活性定義為：在25℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠生成1微摩爾一氧化氮所需的氨基胍敏感性酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列一氧化氮合成酶分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感