知識(shí)分享：WesternBlot實(shí)驗(yàn)方法及注意事項(xiàng)

 

實(shí)驗(yàn)原理：

WesternBlot印跡方法，又稱為免疫印記，是將獲得的蛋白質(zhì)樣品通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，對(duì)不同分子量的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，并通過轉(zhuǎn)移電泳將凝膠上分離到的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非標(biāo)記抗體（一抗）與轉(zhuǎn)印后膜上的靶蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合，再與經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記（偶聯(lián)）的二抗結(jié)合，最后用ECL超敏發(fā)光液試劑檢測。如果轉(zhuǎn)印膜上含有靶蛋白，經(jīng)X光片曝光、顯影后，則會(huì)在X-光片上出現(xiàn)特異性蛋白條帶。

實(shí)驗(yàn)材料：

分離膠及積層膠溶液 、水飽和異丁醇 、1×Tris・Cl/SDS,pH8.8 、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)混合物 、1×SDS電泳緩沖液 、電泳裝置及夾子、玻璃板、灌膠支架、緩沖液槽等附件 、0.75mm封邊墊片 、0.75mm樣品梳子 、50μl微量加樣器 、恒流電源

常用試劑：

1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亞甲丙烯酰胺

將30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亞甲丙烯酰胺溶于總體積為60ml水中，加熱至37℃溶解之，補(bǔ)加水至終體積為100ml。0.45μm微孔濾膜過濾除菌，查證該溶液pH應(yīng)不大于7.0，置棕色瓶中保存。

小心：丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可通過皮膚吸收，其作用具有累積性。稱量丙烯酰胺和N,N’-亞甲丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和面具�？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗�還可能含有少量未聚合材料。

2）4×Tris・Cl/SDS,pH8.8,

在300mlH2O中溶解91g Tris堿(1.5mol/L)，用1mol/L調(diào)節(jié)pH至8.8,補(bǔ)加H2O至體積500ml。用0.45μm濾膜過濾溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。

3）4×Tris・Cl/SDS,pH6.8,

在40mlH2O中溶解6.05g Tris堿(0.5mol/L)，用1mol/L調(diào)節(jié)pH至6.8,補(bǔ)加H2O至體積100ml。用0.45μm濾膜過濾溶液，再加入0.4g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。

4）4×SDS電泳緩沖液

Tris base 24.2 g 、Glycerin 115.3 g 、20%SDS 20 ml

加水至總體積1000ml。

應(yīng)用時(shí)稀釋4倍即為1×SDS電泳緩沖液(Tris 0.05M,Glycerin 0.38M,SDS 0.1%)。

5）TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)

TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亞甲丙烯酰胺的聚合。

6）10%過硫酸銨

過硫酸銨提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和亞甲丙烯酰胺聚合所必需癿自由基�？捎萌ルx子水配制小量10%(w/v)癿貯存液并保存于4℃。由于過硫酸銨會(huì)緩慢分解，故應(yīng)隔周新鮮配制。

實(shí)驗(yàn)步驟：

轉(zhuǎn)染后的樣品，收毒，12000rpm離心，2min，去上清，細(xì)胞碎片就直接進(jìn)行下面步驟：

（1）加入10 x RIPA buffer/每孔200μl，4°裂解30min。

（2）準(zhǔn)備熱變性，用八連管，每孔加入5 x loading buffer  5μl。                

（3）用20μl移液槍，將裂解后的細(xì)胞取出20μl,加入對(duì)應(yīng)的八連管中，并吹打混勻。

（4）封口，用PCR儀進(jìn)行熱變性處理：97°8min。

（5）4°儲(chǔ)存變性后的樣品，待檢。

1、SDS-PAGE凝膠的配制

預(yù)先配制混合液（Tris-HCL/Acr-bis/SDS/H2O）,APS以及TEMED在配制凝膠時(shí)現(xiàn)加。

分離膠：用1.5M Tris-HCL 8.8、10%分離膠。（所謂的10%濃度為Acr-Bis的濃度，即丙烯酰胺的濃度，用水定容，其他成分不變）；濃縮膠：用1M Tirs-HCL 6.8、濃度：5%。

2、上樣電泳：

所用梳子為15孔，Marker占用一孔，故每塊凝膠可以檢測14支樣品。上樣量：Marker：5 μl/孔； 樣品：20μl/孔；參數(shù)：80V，待樣品跑出上樣孔；120V，樣品進(jìn)入分離膠；200V，直至結(jié)束（藍(lán)色指示帶到凝膠底部即完成電泳）

3、轉(zhuǎn)膜：

轉(zhuǎn)膜三明治結(jié)構(gòu)順序：黑色板、網(wǎng)墊、一層濾紙、凝膠（習(xí)慣將Marker放在右側(cè)）、NC膜（在膜的蛋白面左上角做好標(biāo)記）、兩層濾紙、網(wǎng)墊、白色板。

備注：所用的濾紙也分粗糙面和細(xì)膩面，細(xì)膩面對(duì)著凝膠和NC膜，粗糙面對(duì)著網(wǎng)墊。將三明治結(jié)構(gòu)的夾子放入電極時(shí)，黑色板對(duì)應(yīng)電極的黑色一面（負(fù)極）、白色版對(duì)應(yīng)電極的紅色一面（正極）。

強(qiáng)調(diào)：凝膠和NC膜（硝化纖維素膜）的順序千萬不要放反，所用的NC膜分粗糙面和光滑面，粗糙面為接受蛋白面，該面和凝膠直接接觸。蓋槽蓋時(shí)，同樣注意黑色對(duì)應(yīng)黑色、紅色對(duì)應(yīng)紅色；同樣導(dǎo)線電極連接電源的時(shí)候，也是黑色對(duì)黑色、紅色對(duì)紅色。上述任何一步弄反，都會(huì)導(dǎo)致蛋白轉(zhuǎn)膜失敗，切記。

轉(zhuǎn)膜所用參數(shù)：穩(wěn)流45mA，過夜（999min）。

4、封閉

所用封閉液：5% Nonfat milk，用TBST配制，RT（室溫），30min~1h（根據(jù)實(shí)際情況確定時(shí)間，比如封閉液已使用次數(shù)、ECL顯色的背景）。為了防止奶粉變質(zhì)，加入疊氮鈉即NaN3（一種光譜的防腐劑），終濃度為0.02%（本實(shí)驗(yàn)室疊氮鈉儲(chǔ)存液濃度為2%）

洗：TBST，洗去殘余的奶粉。

5、一抗孵育

 所用抗體：mouse，Anti-Flag。

 一抗稀釋：4%BSA by Super Block，1:1000。亦加入0.02%的疊氮鈉NaN3。

孵育：RT，約3h。

洗：TBST，3 x 5min

6、二抗孵育

所用抗體：HRP，anti-mouse。

二抗稀釋：5%Nonfat milk by TBST，1:2000.（二抗一般用兩次或三次就更新）（強(qiáng)調(diào)：二抗中不可以加NaN3，,因?yàn)槠鋾?huì)抑制HRP的活性）

孵育：RT，1h。

洗：TBST，6 x 5min。

7、顯色：ECL。

 A液/B液，各取300μl等體積混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。用熒光筆標(biāo)記好NC膜上的Marker以及上樣孔的位置。將反應(yīng)液均勻的加到膜上（蛋白面），浸濕整張膜，然后輕輕的將膜的蛋白面向下放入顯色儀，蓋上蓋子，點(diǎn)擊開始。

 

注意事項(xiàng)

1、開始配膠的板子一定得夾緊，防止漏膠。

2、上樣的板子也得夾緊，防止漏電緩液，在跑膠出現(xiàn)膠的快慢不一樣，原因上樣前兩塊膠的板子沒有加緊漏電緩液，還有就是膠的濃度不一樣。

3、上樣時(shí)，marker5ul加5 x loading buffer混勻一起上樣，這樣可以防止在跑電泳的過程，樣品把marker給擠的越來越窄。

4、轉(zhuǎn)膜時(shí)，NC膜的正面左上角先用marker筆做好標(biāo)記，防止后面孵育抗體與顯色的過程分不清NC膜的正反面。

5、轉(zhuǎn)膜之前，先把NC膜放在轉(zhuǎn)膜液浸泡，注意從一端慢慢的往下浸泡，否者NC膜容易泡不透，影響轉(zhuǎn)膜。

6、顯色時(shí)，往NC膜上加轉(zhuǎn)膜液也得從一邊慢慢往下加，否者最后顯色效果也不好。

7、轉(zhuǎn)膜時(shí)，NC膜與膠的接觸之前千萬不可有氣泡，否者對(duì)結(jié)果的目的條帶有影響。

常見問題

1、膠片是一片空白，是怎么回事？
如果能夠排除下面的幾個(gè)問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。
1）二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；
2）ECL底物中H2O2不穩(wěn)定，失活；
3） ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；
4）一抗選擇不當(dāng)；
5）二抗失活。
2、背景高咋回事？
膜沒有完全均勻濕透,建議 使用100% methanol浸透膜；
洗膜不充分，可以增加洗液體積和洗滌次數(shù)；
電極不平衡或者加樣位置偏斜，可以調(diào)整電極和加樣；
封閉物用量不足，可以提高封閉物濃度，孵育時(shí)保證封閉液完全浸沒轉(zhuǎn)印膜；
封閉物使用不當(dāng)，比如檢測生物素標(biāo)記的蛋白時(shí)不可用脫脂奶粉封閉；
封閉時(shí)間不夠，一般情況下室溫37度封閉1小時(shí)以上或者4度封閉過夜；
7）抗體非特異性結(jié)合，可以降低抗體濃度，減少孵育時(shí)間
8）一抗稀釋度不適宜，可以對(duì)抗體進(jìn)行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度
9）一抗孵育的溫度偏高，建議4℃結(jié)合過夜
10）抗體濃度過高或洗滌不夠，建議降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù)和時(shí)間
11）化學(xué)顯色底物過多，建議按說明書加入適量的顯色底物
3、為啥條帶形狀不好看？
1）膠凝的不均勻或聚合不好，建議灌膠前將溶液充分混勻
2）某些樣品鹽濃度較高，建議除鹽或?qū)�樣品鹽濃度調(diào)成一致
3) 緩沖液陳舊，成分改變,可以重配
4) 凝膠下面有氣泡,電泳前要先將氣泡趕走
5）電泳時(shí)溫度過高，可以降低電流或電壓
6）樣品中含有不溶性顆粒，建議樣品充分?jǐn)嚢杌靹?br /> 4、蛋白條帶位置（大�。┎粚�(duì)咋整？
膠濃度不對(duì)，不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，可以調(diào)整濃度
抗體孵育不充分,建議增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間
3）酶失活，建議直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物
4）目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體，建議查詢相關(guān)文獻(xiàn)確定
5）標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建議設(shè)置陽性對(duì)照比對(duì)結(jié)果，增加標(biāo)本上樣量
5、有很多雜帶咋回事？
1）目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)，本身可以呈現(xiàn)多條帶，建議查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白實(shí)際大小
2) 樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解,建議加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時(shí)在冰上操作
3）雜蛋白多，建議處理目的蛋白
4）抗體特異性不強(qiáng)，建議使用特異性強(qiáng)的抗體
5）抗體孵育時(shí)間過久，建議減少抗體孵育時(shí)間
6）二抗與抗原有交叉反應(yīng)，建議選擇合適的封閉物
7）二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度
8）底物顯色與曝光時(shí)間過長，建議縮短顯色及曝光的時(shí)間
6、背景有黑色斑點(diǎn)或有不均勻的白色斑點(diǎn)以及暗背景上白色帶
1）抗體與封閉試劑反應(yīng)，建議使用前過濾封閉試劑
2）HRP含量過高，建議降低酶聯(lián)二抗的濃度
3）HRP偶聯(lián)二抗中有聚集體，建議過濾二抗試劑，去除聚集體
4）抗體分布不均勻，建議孵育抗體時(shí)使用搖床
7、細(xì)胞水平要做WB，多少細(xì)胞提的蛋白夠做WB？
答：一般5×10^6就足夠。
8、為什么我的細(xì)胞提取液中沒有檢測到目的蛋白？
可能的原因有：
1）細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；
2）抗體不能識(shí)別目標(biāo)蛋白，多看看說明，是否有問題；
3）可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當(dāng)，樣品放置時(shí)間過長；
4）細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性。
9、我的目的帶很弱，如何加強(qiáng)？
1）可以加大抗原上樣量，這是最主要的；
2）也可以將一抗稀釋比例降低；
3）還可以延長曝光時(shí)間。
10、我做的蛋白質(zhì)分子量很小（10KD），請(qǐng)問怎么做WB？
1）可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系；
2）也可以選擇PSQ 膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。
11、大分子量蛋白200KD，在做WB要注意什么？
1）做200kd蛋白的WB時(shí)要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時(shí)要小心；
2）轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）；
3）轉(zhuǎn)膜液中甲醇含量可適當(dāng)降低，推薦使用濕裝轉(zhuǎn)膜效率更高哦!
12、如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？
可以濃縮樣品，也可以根據(jù)目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會(huì)有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。
13、WB中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？
抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3次。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。
14、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到最佳效果？
無特殊要求。但一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過一兩次的緩沖液。
15、免疫組化和WB可以用同一種抗體嗎？
免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和WB，而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。

 

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