知識(shí)分享：變性梯度凝膠電泳

實(shí)驗(yàn)原理

DNA 雙鏈分子在全長(zhǎng)不斷增加溫度或用化學(xué)變性劑條件處理下，兩條鏈就會(huì)開(kāi)始分開(kāi)（即解鏈）。首先解鏈的區(qū)域由解鏈溫度較低的堿基組成。GC堿基對(duì)比AT堿基對(duì)結(jié)合得要牢固，因此GC含量高的區(qū)域具有較高的解鏈溫度。同時(shí)影響解鏈溫度的因素還有相鄰堿基間的吸引力。解鏈溫度低的區(qū)域，通常位于端部稱(chēng)作低溫解鏈區(qū)。如果端部分開(kāi)，那么雙螺旋就由未解鏈部分束在一起，這一區(qū)域便稱(chēng)作高溫解鏈 (圖1) 。

圖1

如果溫度或變性劑濃度繼續(xù)升高，兩條鏈就會(huì)完全分開(kāi)。變性梯度凝膠電泳法依據(jù)首要的一點(diǎn)是：DNA雙鏈末端一旦解鏈，其在凝膠中的電泳速度將會(huì)極劇下降。第二個(gè)根據(jù)是，如果某一區(qū)域首先解鏈，而與其僅有一個(gè)堿基之差的另一條鏈就會(huì)有不同的解鏈溫度，其電泳速度也會(huì)有明顯差別。因此，將樣品加入含有變性劑梯度的凝膠進(jìn)行電泳就可將二者分開(kāi)（圖 2, 1 和 2 道）。

圖2

最終，如果一雙鏈在其低溫解鏈區(qū)堿基錯(cuò)配（異源雙鏈），而與另一等同的雙鏈相比差別僅在于此，那么，含有錯(cuò)配堿基的雙鏈將在低得多的變性劑濃度下解鏈。事實(shí)上，樣品通常含有突變、正常的同源雙鏈以及配對(duì)的異源雙鏈，后者是在PCR擴(kuò)增加時(shí)產(chǎn)行的。而含有錯(cuò)配的雙鏈（圖2中的3和4道）通常可以遠(yuǎn)遠(yuǎn)地與兩個(gè)同源雙鏈（圖2中1和2道）分開(kāi)，這種分離效果使該方法靈敏度很高。為使僅有一個(gè)堿基之差的不同分子取得最好的分離效果，必須先選擇所要研究的DNA范圍以及電泳樣品時(shí)變性劑濃度梯度。這可以按圖 2 所示的正交變性梯度實(shí)驗(yàn)進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性地解決。變性劑梯度應(yīng)選在曲線(xiàn)斜率大的部分，因?yàn)檫@時(shí)多數(shù)分子處于部分變性狀態(tài)這使得落入低溫解鏈區(qū)的不同分子達(dá)到最佳分離。

現(xiàn)在多數(shù)分析實(shí)驗(yàn)是加入了“GC夾板”（clamp）。它是將一段長(zhǎng)度為30-50堿基，富含GC的DNA 附加到雙鏈的一端以形成一個(gè)人為高溫解鏈區(qū)。這樣，片段的其他部分就處在低溫解鏈區(qū)從而可以對(duì)其進(jìn)分析。

實(shí)驗(yàn)材料

1、實(shí)驗(yàn)儀器：電泳控溫槽一臺(tái)、電泳支架、程控電泳儀、梯度混合儀一套、緩沖液虹吸泵、凝膠成像儀；

2、實(shí)驗(yàn)試劑：

（1）40%的凝膠單體（丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺：37.5/1）：稱(chēng)取38.93g丙烯酰胺和1.07g甲叉雙丙烯酰胺，加入去離子水定容至100ml后用0.45μm的濾膜過(guò)濾后裝入棕色瓶4°C保存。

（2）100%變性劑：取42ml去離子甲酰胺、42g尿素，用去離子水定容至100 ml后用0.45μm的濾膜過(guò)濾后裝入棕色瓶4°C保存。

（3）50×TAE緩沖液（Tris 2mol/L， 冰醋酸 1mol/L，EDTA 50mmol/L，pH8.0） ；

（4）10%過(guò)硫酸銨溶液（W/V，為保證良好的引發(fā)效果，建議現(xiàn)配現(xiàn)用） ；

（5）TEMED（分析純）。

（6）梯度變性膠的配方（濃度為8%的變性膠）

（7）梯度變性膠的配方（濃度為6%的變性膠）

實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1、將兩塊玻璃對(duì)齊放入電泳支架上（帶缺口的玻璃缺口朝上并位于內(nèi)側(cè)），旋緊固定螺絲并夾好夾子。注入去離子水，檢測(cè)是否漏水后倒出去離子水。

2、配制高變性劑濃度凝膠溶液和低變性劑濃度凝膠溶液，在灌膠前加入適量的10%過(guò)硫酸銨溶液和TEMED作為聚合引發(fā)劑和催化劑并充分混勻。關(guān)閉梯度混合儀的兩個(gè)閥門(mén)，將高濃度變性劑凝膠溶液加入梯度混合儀靠近出口的一端，將低濃度變性劑凝膠溶液加入另一端，并打開(kāi)磁力攪拌器。

3、先打開(kāi)梯度混合儀出口端閥門(mén)，待液流穩(wěn)定無(wú)氣泡時(shí)將針頭插入兩塊玻璃縫隙中部，接著打開(kāi)梯度混合儀中間閥門(mén)開(kāi)始灌膠。

4、待凝膠灌至距上端1.5cm處時(shí)停止灌膠，加入1mL去離子水液封膠面，待凝膠聚合后，配制不含變性劑的0%凝膠，用移液器灌膠，插好梳子，待凝膠完全聚合。

5、拔出梳子，將電泳支架放入恒溫電泳槽，將各個(gè)PCR產(chǎn)物與Loading buffer混勻，然后用微量上樣器吸取樣品并加到各個(gè)上樣孔中（每個(gè)孔的DNA含量為500-800ng，PCR產(chǎn)物在瓊脂糖電泳時(shí)與Marker比較計(jì)算其大概含量，使得梯度變性膠每個(gè)孔樣品中的DNA含量盡量一致）。 一切就緒后，準(zhǔn)備開(kāi)始電泳，電壓設(shè)定為第一階段60V，時(shí)間1h 第二階段100V，時(shí)間16h，電泳儀全自動(dòng)定時(shí)分段編程。

6、電泳結(jié)束后，拿出電泳架取出玻璃，將一側(cè)玻璃揭去，用EB或SYBR Green染色30min后取出凝膠，置于凝膠成像儀中拍照。

注意事項(xiàng)

1、實(shí)驗(yàn)中提取DNA，以及DGGE操作中接觸到得較多易揮發(fā)有機(jī)試劑和有毒試劑，操作過(guò)程中須注意做好防護(hù)。

2、膠濃度根據(jù)PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度選定，一般150-400bp的選用8％的膠，400bp以上的選用6％的膠。

3、變性劑濃度范圍根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道并針對(duì)具體樣品做適當(dāng)調(diào)整，使最終條帶位于變性膠中部。

4、引發(fā)劑和催化劑的具體用量可以根據(jù)氣溫以及實(shí)驗(yàn)人對(duì)聚合速度的要求等具體實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行調(diào)整，文檔表格中列出的是參考用量。

5、配膠用的玻璃板須洗刷干凈，避免雜質(zhì)引起氣泡等影響凝膠的一體性，加入凝膠液之前須注意檢查玻璃板是否漏水。

6、拔取梳子的時(shí)候要注意切勿破壞上樣孔，可先將凝膠放入電泳緩沖液中浸泡，然后拔取。

7、電泳槽中提前裝入1×TAE緩沖液21L，溫度設(shè)置為60°C，插上電極和緩沖液循環(huán)管，預(yù)熱電泳緩沖液。

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