石蠟切片免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟

脫蠟和水化

1.   將切片依次浸入二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ（10 min）。

2.   再次浸入無水乙醇Ⅰ（5 min）-無水乙醇Ⅱ（5 min）-95%酒精（5 min）-80%酒精（5 min）-70%酒精（5 min），然后去離子水沖洗2次，每次2 min。

抗原修復(fù) (可選)

3.   將組織切片放入修復(fù)盒，然后加入適量0.01M枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）或EDTA修復(fù)液（pH 9.0），液面要浸沒組織。

4.   微波中檔修復(fù)10 min（液體沸騰時開始計時），此過程中勿使組織干片。

5.   將修復(fù)盒從微波爐中拿出，自然冷卻降溫，當(dāng)修復(fù)液降至室溫后取出玻片，PBS（pH 7.4）沖洗3遍，每次3 min（沖洗過程中切勿對著組織沖洗，以免弄破組織）。

滅活

6.   將配制好的3%的過氧化氫（去離子水稀釋30%過氧化氫）滴加于切片組織上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min。

抗體孵育

7.   吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加5%的正常血清（與二抗種屬來源一致或相似），37℃封閉30 min。

8.   用吸水紙擦干玻片組織周圍的液體，用油性筆在組織周圍畫圈，然后滴加稀釋好的一抗，如果做陰性對照實(shí)驗(yàn)，就在對照組的組織上滴加PBS。加完一抗后于4 °C濕盒中孵育過夜。（抗體的最佳稀釋比應(yīng)預(yù)先通過實(shí)驗(yàn)確定，時間控制在15h以上）。

9.   PBS 沖洗切片3次，每次3 min，吸水紙擦干切片后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗 ，37 ℃孵育30 min。

信號檢測

10.   PBS沖洗切片4次，每次3 min，甩去PBS液體后吸水紙擦干切片，每張切片滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，陽性信號為棕黃色或棕褐色，時間要控制好，切勿顯色過深。用自來水沖洗切片終止顯色。

11.   Harris蘇木素復(fù)染，一般30 s-1 min左右，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用自來水沖洗返藍(lán)。（染核，可選）

脫水固定封片

1.   將切片置于水中沖洗后，將切片依次放入：70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-無水乙醇Ⅰ-無水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ中脫水透明，每個試劑中放置2 min，最后在通風(fēng)櫥中風(fēng)干切片。
2.   將中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上。先放平一側(cè)，然后輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好的切片平躺置于通風(fēng)櫥中晾干。
3.   晾干的切片可以在顯微鏡下觀察或采集圖像。