單細胞ICP-MS聯(lián)合HCS為您揭秘順鉑化療耐藥機制

 

順鉑（Cisplatin）是1978年經(jīng)FDA批準用于臨床治療癌癥的化療藥物。順鉑藥物的治療機制是通過結(jié)合形成Pt-DNA復(fù)合物，干擾DNA復(fù)制合成，從而殺死快速增殖的癌細胞，屬于細胞周期非特異性藥物。許多癌癥患者最初對基于鉑類的治療比較敏感，但一段時間后，患者通常對順鉑治療表現(xiàn)出耐藥性，導(dǎo)致了癌癥復(fù)發(fā)。因此在化療后細胞必須修復(fù)DNA 損傷，否則DNA 復(fù)制受阻會導(dǎo)致細胞死亡。對于順鉑的耐藥機制研究，也是目前抗癌藥物研究熱點。目前三種主要的分子機制包括DNA 修復(fù)加速，胞漿失活加速和細胞攝取藥物能力的變化。其中，細胞攝取藥物能力的變化主要表現(xiàn)在細胞對順鉑的攝入能力降低及順鉑轉(zhuǎn)運加速。

 

 

細胞內(nèi)順鉑的攝入與腫瘤負荷相關(guān)，也就是說腫瘤對順鉑反應(yīng)降低會導(dǎo)致細胞內(nèi)順鉑的含量降低。所以，分析單個細胞水平對順鉑的攝入和分布對于評估治療的有效性具有非常重要的意義。過多順鉑進入細胞內(nèi)會增加DNA 損傷和細胞死亡的頻率。了解單個細胞水平及細胞亞群對順鉑的攝入的機制將能為新療法的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，以改善腫瘤對順鉑的耐藥性，降低腫瘤復(fù)發(fā)率。

 

單細胞電感耦合等離子體質(zhì)譜 (SC-ICP-MS)是以單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)，測量單個細胞（或單個納米顆粒）在進入等離子體時產(chǎn)生的離散信號，對溶液中對金屬元素進行評估與定量。每個細胞中的金屬成分離子化，產(chǎn)生離子流，檢測器以每秒100000 數(shù)據(jù)點的速度快速對信號采集測量，從而使得單個細胞中的金屬含量能被定量到阿克（ag）/ 每細胞的水平。相比測量細胞內(nèi)順鉑攝入的傳統(tǒng)方法，SC-ICP-MS 所得結(jié)果的信息量更加全面。

通過對兩株卵巢癌細胞系A2780（順鉑敏感型）和A2780/CP70（順鉑耐藥型）順鉑攝入量的實時檢測發(fā)現(xiàn)：相比A2780 敏感細胞系，順鉑攝入在耐藥性的A2780/CP70 細胞系上水平降低；但順鉑攝入的細胞差異性不是由于細胞周期的不同，因為血清饑餓細胞并不改變順鉑的整體攝入。順鉑攝入的胞內(nèi)差異性是由于其他尚未確定的因素造成的。

 

 

“三陰性”乳腺癌（Triple-Negative Breast Cancers, TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體（HER2）均陰性的一種特殊類型乳腺癌。“三陰性”乳腺癌約占所有乳腺癌的10-20%， 但因其缺乏內(nèi)分泌及抗HER2治療的靶點，目前治療尚以傳統(tǒng)外科切除、化療及放療為主。鉑類藥物化療是目前針對晚期乳腺癌治療的標準治療方案。[2]順鉑類藥物已被報道通過解偶聯(lián)DNA復(fù)制周期和中心粒復(fù)制調(diào)控造成中心粒擴增，從而抑制腫瘤細胞增殖。[3]

 

Nirmech Patel等人2018年Nature communication雜志上，結(jié)合整合基因組學(xué)、RNAi技術(shù)和功能型驗證，在乳腺癌和非惡性細胞上對130多個潛在基因研究發(fā)現(xiàn)，有13個基因簇通過影響細胞周期檢驗點、DNA損傷應(yīng)答和惡性細胞選擇性分裂上調(diào)“三陰性”乳腺癌發(fā)病傾向。其中KIFC1驅(qū)動蛋白作為高選擇性的惡性細胞靶標，通過順鉑化療與KIFC1聯(lián)合協(xié)同效果的研究結(jié)果進一部表明，KIFC1最有潛力成為新型藥物靶點。[4]

在研究順鉑化療藥物與KIFC1協(xié)同治療實驗設(shè)計中，兩個關(guān)鍵的單細胞水平研究方法：中心粒擴增打分和多極性有絲分裂實驗，都是使用Operetta 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)進行共聚焦高分辨率圖像采集后，再通過Hamony軟件對中心粒擴增和多極性有絲分裂進行自動數(shù)據(jù)分析及數(shù)據(jù)挖掘。

 

 

為在乳腺癌細胞模型上確認KSFC1與中心粒擴增的相關(guān)性，11種乳腺癌相關(guān)的細胞株用于中心粒擴增打分實驗。免疫熒光方法標記中心粒組裝關(guān)鍵蛋白激酶Aurora A（綠色）和中心粒標記物CP110（紅色），Hoechst標記細胞核（藍色），通過Operetta高內(nèi)涵成像獲取高分辨率圖像，如下圖b中所示，Low CA組中心粒數(shù)量、熒光強度和面積都遠低于High CA組，后續(xù)通過Hamony軟件對中心粒擴增進行分析打分，發(fā)現(xiàn)針對KIFC1基因的#2/#4/#5/#6四組SiRNA能有效增加KIFC1依賴的中心粒擴增。

 

 

免疫熒光標記Aurora A（綠色）和雙極有絲分裂驅(qū)動蛋白Eg5（紅色），Hoechst標記細胞核（藍色），通過Operetta高內(nèi)涵成像獲取高分辨率圖像及Hamony軟件進行多極性有絲分裂分析打分，發(fā)現(xiàn)在3株中心粒高擴增的細胞系和4株中心粒低擴增細胞系中，KIFC1沉默都能顯著提高單個細胞的紡錘體數(shù)量，造成有絲分裂多極性（下圖a-b）。并且通過在MDA-MB-231細胞株上的實時動態(tài)檢測進一步驗證了KIFC1沉默對有絲分裂多極性的影響（下圖c）。 

后續(xù)通過進一步實驗研究驗證，順鉑藥物能提高中心粒擴增，且能在KIFC1沉默的情況下，提高順鉑藥物對中心粒擴增的敏感性。這就意味著KIFC1蛋白可以作為順鉑化療藥物聯(lián)合治療的潛在藥物靶點，用于針對三陰性乳腺癌患者的精準治療方案。

 

 

1. 最新研究進展——利用單細胞電感耦合等離子體質(zhì)譜評估卵巢癌細胞對順鉑的攝入

2. Untch, M. et al. ABC3 consensus commented from the perspective of the German guidelines: Third International Consensus Conference for Advanced Breast Cancer (ABC3), Lisbon, 07. 11. 2015. Geburtshilfe Frauenheilkd. (2016) 76,156–163.

3. Zou, J. et al. FancJ regulates interstrand crosslinker induced centrosome amplification through the activation of polo-like kinase 1. Biol. Open  (2013) 2,1022–1031.

4. Nirmesh Patel et al. Integrated genomics and functional validation identifies malignant cell specific dependencies in triple negative breast cancer. Nature Communication (2018) 9:1044.