Cognition Wall全新學(xué)習(xí)認(rèn)知工具在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用：助力復(fù)旦腦院Cell子刊封面

全世界各個(gè)科研大國(guó)的腦計(jì)劃，起因于人們對(duì)行為及大腦探秘的高度關(guān)注。Nature不久前的一篇報(bào)道闡述到，中國(guó)腦科學(xué)研究所于2018年3月22日正式在北京成立，中國(guó)腦計(jì)劃實(shí)體店終開(kāi)，北京大學(xué)饒毅與NIBS北京生命科學(xué)研究所羅敏敏共同主管。此舉也是繼2013年歐美的腦計(jì)劃、日本2014年的類似小的項(xiàng)目、韓國(guó)2016年后中國(guó)的跟進(jìn)。北京市政府資助1.8億人民幣，五年內(nèi)招募約5-6個(gè)課題組約50名研究者，之后希望借助腦計(jì)劃每年大約需4億人民幣。不難看出，對(duì)大腦的研究是一個(gè)極其重要而艱難的任務(wù)，任重道遠(yuǎn)，需要相關(guān)領(lǐng)域科研工作者貢獻(xiàn)自己的才智、見(jiàn)識(shí)與勤勉。本文接下來(lái)是對(duì)學(xué)習(xí)與記憶機(jī)制研究的相關(guān)文章進(jìn)行解讀與闡釋。

 

TRPM7在不同發(fā)育階段對(duì)維持正常突觸密度以及學(xué)習(xí)記憶是必不可少的

在復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院、醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究員那德（Nashat Abumaria）課題組的努力下，其研究成果發(fā)表在Cell Reports的封面上，影響因子IF為8.032，鑒于榮登封面，價(jià)值高于影響因子。

文章關(guān)注的是一種通道酶TRPM7，因?yàn)樗�在很多組織都有，這里關(guān)注的是它在CNS中樞神經(jīng)系統(tǒng)并且是生理情況下非病理情況下的功能與角色,確切的是海馬區(qū)的神經(jīng)元Knockdown敲低以后發(fā)現(xiàn)突觸密度減少，但這一現(xiàn)象可以通過(guò)C端激酶區(qū)得到挽救，挽救的機(jī)制可能是磷酸化下游的cofilin蛋白(Cofilin是普遍存在于真核細(xì)胞的一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白.Cofilin的基本功能是在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合和解聚F肌動(dòng)蛋白)；出生后小鼠knockout敲除以后損傷了學(xué)習(xí)記憶以及減少了突觸密度以及突觸可塑性，成年大鼠海馬區(qū)knockdown以后也損傷了學(xué)習(xí)記憶以及減少了突觸密度以及突觸可塑性；

 

 

為了研究這個(gè)通道酶對(duì)學(xué)習(xí)與記憶的影響，文章選取了小鼠與大鼠這兩種模式動(dòng)物，為了細(xì)致觀察這種通道酶的功能，做了Knockdown敲低（針對(duì)成年大鼠）以及Knockout敲除（針對(duì)出生后小鼠）這兩種處理方式，輔以挽救實(shí)驗(yàn)即在Knockout敲除的小鼠大腦內(nèi)又注射回該酶以觀察效果（針對(duì)小鼠，并針對(duì)該酶的部分區(qū)域即激酶區(qū)域），對(duì)于主要的衡量指標(biāo)包括突觸密度、突觸可塑性以及學(xué)習(xí)與記憶行為，前兩種的衡量方法屬于比較常規(guī)的抗體染色顯微成像、體外電生理記錄，后一種課題組采用了荷蘭諾達(dá)思全新的Cognition Wall認(rèn)知墻工具評(píng)判學(xué)習(xí)與記憶行為，值得關(guān)注。后面會(huì)具體談到。

 

1、體外細(xì)胞層面

首先體外情況如何，在細(xì)胞層面，Knockdown敲低TRPM7的表達(dá)，看看海馬體神經(jīng)元的情況，當(dāng)然敲除后表達(dá)量減少了并且不影響其它蛋白的表達(dá)并且不影響神經(jīng)元的生長(zhǎng)，另外關(guān)鍵的發(fā)現(xiàn)突觸密度顯著減少，突觸素等也顯著下降! 

 

上圖左邊是對(duì)照組，右邊是敲低后的實(shí)驗(yàn)組，可以看出各種重要染色顯示敲低后突觸密度、突觸素顯著下降。上面的諸多敲低后的結(jié)果到底是什么在起作用，于是展開(kāi)挽救實(shí)驗(yàn)，提高鎂離子和鋅離子濃度，不行，甚至發(fā)現(xiàn)后來(lái)兩者的細(xì)胞內(nèi)濃度與TRPM7無(wú)關(guān)了，看來(lái)非離子通道在突觸密度減少起作用；后來(lái)加入C端激酶區(qū)域，發(fā)現(xiàn)突觸密度顯著提高！

 

上面六張熒光圖，第二張即是加入C端激酶區(qū)域，發(fā)現(xiàn)突觸密度顯著提高，而第三張是突變了的C端激酶發(fā)現(xiàn)就不能提高，其特異性可見(jiàn)！

 

2、動(dòng)物模型層面

進(jìn)入到小鼠與大鼠的動(dòng)物階段！

采用特定knockout的小鼠，大腦特定區(qū)域基因敲除了TRPM7看看實(shí)際的個(gè)體層面的情況，檢查一些基本的行為參數(shù)比如運(yùn)動(dòng)活性、探索新物體的動(dòng)機(jī)，這些都是正常的。新物體識(shí)別的認(rèn)知參數(shù)，敲掉后小鼠明顯下降。學(xué)習(xí)認(rèn)知實(shí)驗(yàn)中，敲除后的小鼠明顯學(xué)習(xí)能力下降，只有40%的小鼠學(xué)會(huì)了認(rèn)知墻實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)階段獲取了更少的顆粒獎(jiǎng)勵(lì)，記憶階段更少地做出了正確的選擇。而且CA1區(qū)域(海馬體的一個(gè)區(qū)域)的突觸密度也顯著下降。并且突觸前末端密度減少、突觸后場(chǎng)興奮電位下降，這些都表明基因敲除的小鼠突觸的可塑性受損了。

 

圖1：

 

圖2：

圖1左邊是黑色的是對(duì)照組的突觸密度，右邊黑色的是敲除組的突觸密度，明顯下降！圖2測(cè)定的是場(chǎng)興奮性突觸后電位，黑色的是對(duì)照組的LTP長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，紅色的是敲除組的LTP長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，明顯突出的可塑性受損！

這些突觸密度的下降、突觸可塑性的受損，反應(yīng)到行為學(xué)上則是學(xué)習(xí)認(rèn)知的問(wèn)題。

 

采用荷蘭諾達(dá)思的Cognition Wall認(rèn)知墻工具進(jìn)行學(xué)習(xí)認(rèn)知行為的研究  

 

Cognition Wall認(rèn)知墻工具包含EthoVision軟件系統(tǒng)以及PhenoTyper小鼠家居箱以及三孔認(rèn)知墻等。動(dòng)物從特定的入口進(jìn)入（上圖顯示綠色的入口），則軟件自動(dòng)給予食物獎(jiǎng)勵(lì)（上圖藍(lán)色的顆粒顯示）該實(shí)驗(yàn)全程自動(dòng)，不需要人為干預(yù)，軟件自動(dòng)控制硬件并自動(dòng)記錄數(shù)據(jù)并自動(dòng)分析數(shù)據(jù)。

 

實(shí)驗(yàn)如下：

• 實(shí)驗(yàn)前一周小鼠在標(biāo)準(zhǔn)的鼠籠單籠飼養(yǎng)；
• 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前11個(gè)小時(shí)前將小鼠放入小鼠家居箱，讓其適應(yīng)環(huán)境，即大約晚上8:30將小鼠放入，可以進(jìn)水限制進(jìn)食；
• 這個(gè)適應(yīng)階段放入10粒食物，使小鼠能找到食物給予的地方
• 早上7:30放入認(rèn)知墻，早上8:00開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，全程自動(dòng)進(jìn)行；
• 這個(gè)過(guò)程小鼠需要連續(xù)進(jìn)入左邊的孔5次則軟件自動(dòng)控制硬件給予一粒食物（即上圖綠色的孔）。

 

Tip:本文的小鼠節(jié)律是晚上8點(diǎn)開(kāi)燈至第二天早上8點(diǎn)關(guān)燈，后期采用紅色昏暗的燈光作為晚上時(shí)間，即light phase 8:00pm-8:00am dark phase 8:00am-8:00pm其中dark phase為實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)段。

以下圖示為實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

從從結(jié)果可以看出，基因敲除的紅色線的小鼠只有40%的學(xué)會(huì)了認(rèn)知墻！對(duì)照組全部學(xué)會(huì)！對(duì)比明顯！

在一天后的記憶測(cè)試階段，將小鼠重新放回帶有認(rèn)知墻的家居箱，在1個(gè)小時(shí)的測(cè)試中計(jì)算小鼠做出正確選擇的比例（即從左邊孔進(jìn)入）。

 

從結(jié)果可以看出，基因敲除的紅色線的小鼠做出正確選擇的比例明顯低于對(duì)照組。

 

為了確保食物獎(jiǎng)勵(lì)的裝置沒(méi)有問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)者亦手動(dòng)數(shù)了每只小鼠在學(xué)習(xí)過(guò)程中獲得的食物獎(jiǎng)勵(lì)的數(shù)目，因?yàn)槭澄铼?jiǎng)勵(lì)的數(shù)目與小鼠的學(xué)習(xí)能力是相關(guān)的。

 

明顯，基因敲除的小鼠獲取食物獎(jiǎng)勵(lì)的數(shù)目少于對(duì)照組，學(xué)習(xí)能力明顯弱于對(duì)照組。

沒(méi)有完！在小鼠模型上注射C端激酶的病毒進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組、激酶組、突變激酶組，一個(gè)月后做行為學(xué)測(cè)試后處死進(jìn)一步分析，新物體識(shí)別的認(rèn)知參數(shù)，對(duì)照組和激酶組都明顯高于突變激酶組。學(xué)習(xí)認(rèn)知實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組和激酶組都明顯學(xué)習(xí)得更快，記憶測(cè)試也更多地做出了正確的選擇。當(dāng)然突觸密度與突觸可塑性均高于突變組。

 

 

這和最開(kāi)始的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)了起來(lái)，在動(dòng)物模型上并且是行為實(shí)驗(yàn)上驗(yàn)證了C端激酶對(duì)學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵作用。

 

當(dāng)然以大鼠為模型，在特定knockdown的大鼠，確定敲低其表達(dá)以后，同樣基本的行為參數(shù)是沒(méi)有差異的，后測(cè)定大鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力，T迷宮空間學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)（敲低后做出正確選擇的比例明顯下降）、短期再認(rèn)記憶（過(guò)去經(jīng)驗(yàn)或識(shí)記過(guò)的事物再次呈現(xiàn)在面前時(shí)仍能確認(rèn)和辨認(rèn)出來(lái)的過(guò)程）也受損、背景記憶也受損，當(dāng)然突觸密度與突觸可塑性均明顯下降 。

 

 

最后一個(gè)話題，文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)cofilin參與的一些功能和TRPM7敲除后很類似，提出假設(shè)在學(xué)習(xí)認(rèn)知層面TRPM7可能借助cofilin參與了下游的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)敲除后cofilin磷酸化（抑制）顯著減少，而激酶組的cofilin確實(shí)磷酸化得到了恢復(fù)，并驗(yàn)證了兩者是直接結(jié)合的。

當(dāng)然下游這塊研究還是比較簡(jiǎn)單，偏向于現(xiàn)象的關(guān)聯(lián)，未能直接與學(xué)習(xí)記憶做深入研究。另外，激酶的功能是通過(guò)突觸前、突觸后來(lái)調(diào)控突觸密度的機(jī)制也需要進(jìn)一步闡明。

 

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參考文獻(xiàn)：

Liu YQ#,Chen C# ,Liu YL#,Li W, Wang ZH,Sun QF,Zhou H,Chen XJ,Yu YC,Wang Y, Nashat Abumaria*. (2018) TRPM7 Is Required for Normal Synapse Density, Learning, and Memory at Different Developmental Stages .Cell Reports.23(12):3480–3491