【研究案例】Autophagy | 自噬與子宮內(nèi)膜異位癥

2018年7月2日，復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院李明清研究員課題組在《Autophagy》上發(fā)表了最新的研究成果“Suppression of autophagy and HCK signaling promotes PTGS2^high FCGR3^- NK cell differentiation triggered by ectopic endometrial stromal cells”，揭示了子宮內(nèi)膜異位微環(huán)境中，雌激素-自噬-STAT3-HCK軸參與了PTGS2^high FCGR3^-NK細(xì)胞的分化，為治療NK細(xì)胞殺傷活性受損相關(guān)疾病提供了科學(xué)依據(jù)。

南模生物為該研究構(gòu)建了HCK基因敲除小鼠模型。

子宮內(nèi)膜異位癥（EMS）是指有活性的內(nèi)膜細(xì)胞種植在子宮內(nèi)膜以外的位置，它是一種雌激素依賴的婦科疾病。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)NCAM1^dim FCGR3⁺ NK細(xì)胞和NCAM1^bright FCGR3^-（一類低殺傷活性、主要分泌細(xì)胞因子的）NK細(xì)胞比例的失衡和NK細(xì)胞殺傷活性不足與多種生理和病理過程相關(guān)，包括正常妊娠、傳染病、惡性腫瘤等等，其中也包括子宮內(nèi)膜異位癥。NK細(xì)胞殺傷活性不足會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥中局部免疫環(huán)境的功能失調(diào)，影響異位子宮內(nèi)膜組織的清除。不過在異位病變微環(huán)境（ELM）中NK細(xì)胞殺傷活性受損的原因仍不清楚。

在該課題組早前的研究中，發(fā)現(xiàn)異位內(nèi)膜細(xì)胞（ESCs）的自噬水平下降，雌激素引起的EMS自噬抑制是依靠CXCL12/CXCR4的相互作用，部分通過 NF-κB信號(hào)通路。不過，ESCs的自噬水平與NK細(xì)胞的功能與殺傷活性降低的關(guān)系仍有待研究。因此，這項(xiàng)研究就旨在闡述ESCs自噬是否會(huì)調(diào)節(jié)FCGR3⁺ NK細(xì)胞與FCGR3^- NK細(xì)胞之間的平衡，以及這些異常自噬的ESCs和NK細(xì)胞在EMS發(fā)展中的影響。

研究結(jié)果

（1）隨著病程發(fā)展，異位病變微環(huán)境（ELM）中FCGR3^- NK與FCGR3⁺ NK細(xì)胞的比例增加。

Fig1. The low cytotoxic FCGR3^- NK cells increase in ELM with disease progression.

（2）異位內(nèi)膜細(xì)胞（ESCs）自噬水平下降，通過STAT3失活引發(fā)HCK下調(diào)，且HCK下游分子CXCL8/IL8-IL23A的分泌增加，從而導(dǎo)致FCGR3^- NK細(xì)胞的增加以及NK細(xì)胞殺傷活性的降低。

與正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞相比，異位內(nèi)膜細(xì)胞的自噬相關(guān)基因（MAP1LC3B，也叫LC3B和BECN1，也叫Beclin1）表達(dá)水平顯著下降。通過將FCGR3^- NK細(xì)胞分別與抑制自噬（3-MA-ESC和siATG5-ESC）、促進(jìn)自噬（Rap-ESC）和未處理（Ctrl-ESC）的異位內(nèi)膜細(xì)胞共培養(yǎng)，來模擬體內(nèi)微環(huán)境，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未處理的ESCs共培養(yǎng)后FCGR3- NK細(xì)胞比例上升、而且KIR2DL1和KIR3DL1表達(dá)上調(diào)、NCR3, NCR2, IFNG, PRF1和GZMB表達(dá)下調(diào)；而與抑制了自噬的ESCs共培養(yǎng)的NK細(xì)胞這種變化更加強(qiáng)烈，與促進(jìn)自噬的ESCs共培養(yǎng)則會(huì)減弱這些變化（Fig2）。

自噬水平的下降觸發(fā)了PKH26⁺ FCGR3⁺ NK細(xì)胞亞群向PKH26⁺ FCGR3^- NK細(xì)胞的分化，同時(shí)小鼠EMS模型在注射自噬抑制劑3-MA后也表現(xiàn)出子宮內(nèi)膜異位和腹膜液中FCGR3^- NK細(xì)胞的增加（Fig3）。

Fig2 The low autophagy of ESCs leads to the high level of FCGR3^- NK cells in vitro.

Fig3 The low autophagy of ESCs triggers more differentiation of FCGR3^- NK cells from FCGR3⁺ NK cells.

 通過分析FCGR3^- NK細(xì)胞的基因表達(dá)芯片，發(fā)現(xiàn)HCK（造血細(xì)胞激酶）在異位ESCs中的表達(dá)呈現(xiàn)顯著下降，同時(shí)隨自噬水平的變化而變化。ATG5失活導(dǎo)致自噬水平、HCK表達(dá)以及STAT3磷酸化水平下降；而STAT3抑制劑可以部分抑制由于自噬水平上調(diào)引起的HCK表達(dá)上調(diào)。說明自噬通過STAT3來調(diào)節(jié)HCK水平（Fig4）。

將HCK基因敲除小鼠子宮內(nèi)膜碎片注射到野生型小鼠體內(nèi)來制備HCK缺失的EMS模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明HCK缺失會(huì)加快病程的發(fā)展、增加FCGR3^- NK細(xì)胞，但PRF1⁺、GZMB⁺、IFNG⁺ NK細(xì)胞減少（Fig5）

Fig4 ESC autophagy upregulates expression of HCK by activating STAT3 signaling pathway.

Fig5 Hck downregulates FCGR3^- NK cells.

在對(duì)HCK下游靶基因的分析中，發(fā)現(xiàn)CXCL8和IL23A水平受HCK和自噬水平的影響，HCK-/-EMS模型或自噬抑制劑3-MA處理后，IL23A表達(dá)上調(diào)（Fig6）。體外對(duì)CXCL8和IL23A過表達(dá)和RNAi，發(fā)現(xiàn)HCK-CXCL8-IL23A軸確實(shí)參與調(diào)節(jié)FCGR3^- NK細(xì)胞的分化（Fig7）。

Fig6  The low level of autophagy and HCK signaling stimulates the secretion of CXCL8 and IL23A by ESCs.

Fig7  The HCK-CXCL8-IL23A signal axis of ESCs regulates FCGR3^- NK cells differentiation.

（3）FCGR3^- NK細(xì)胞的分化受MIR1185-1-3p負(fù)調(diào)控，其下游靶基因PTGS2會(huì)增加FCGR3- NK細(xì)胞，促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位的發(fā)展。

通過比較ESCs自噬受到抑制以后NK細(xì)胞中microRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)9個(gè)microRNA表達(dá)變化顯著。而其中，只有MIR1185-1-3p在與抑制自噬的ESCs共培養(yǎng)的NK細(xì)胞中表達(dá)下降；在促進(jìn)自噬的ESCs共培養(yǎng)的NK細(xì)胞中表達(dá)上升。同時(shí)，CXCL8和IL23A下調(diào)MIR1185-1-3p水平�；颊吒鼓ひ褐蠳K細(xì)胞的MIR1185-1-3p也呈低水平表達(dá)。體外MIR1185-1-3p過表達(dá)的NK細(xì)胞中FCGR3、PRF1、GZMB和IFNG表達(dá)下降。說明自噬和HCK水平調(diào)節(jié)MIR1185-1-3p，從而負(fù)調(diào)控FCGR3-PRF1^low GZMB^low IFNG^low NK細(xì)胞分化（Fig8）。

Fig8 The FCGR3^- NK cell differentiation in ELM is negatively regulated by MIR1185-1-3p.

通過對(duì)比芯片差異數(shù)據(jù)與MIR1185-1-3p下游潛在靶基因，只找到一個(gè)重合基因——PTGS2。MIR1185-1-3p過表達(dá)會(huì)抑制PTGS2表達(dá)。EMS小鼠模型中，HCK缺失導(dǎo)致PTGS2⁺ NK細(xì)胞的增加（Fig9）。而與PTGS2^- NK細(xì)胞相比，PTGS2⁺ NK細(xì)胞的FCGR3、PRF1 和 IFNG的表達(dá)很低。在PTGS2基因敲除小鼠中FCGR3⁺ PRF1⁺ GZMB⁺ IFNG⁺ NK細(xì)胞比例更高（Fig10）。

Fig9 The autophagy and HCK signaling of ESCs are involved in regulating the PTGS2 level in NK cells by MIR1185-1-3p.

Fig10 There are more FCGR3⁺ PRF1⁺ GZMB⁺ IFNG⁺ NK cells in PF and the uterus of ptgs2^-/- mice.

FCGR3表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致NK細(xì)胞中PTGS2表達(dá)上調(diào)，且PRF1⁺GZMB⁺ IFNG⁺ NK細(xì)胞比例減少。抑制FCGR3和抑制PTGS2在影響PTGS2、PRF1、GZMB表達(dá)中的作用剛好是相反的。而且，在子宮內(nèi)膜異位癥中PTGS2⁺FCGR3^- NK細(xì)胞與PTGS2^-FCGR3⁺ NK細(xì)胞的比例顯著上升，PTGS2⁺FCGR3^- NK細(xì)胞的GZMB、PRF1 和 IFNG低表達(dá)（Fig11）。說明PTGS2和FCGR3之間存在負(fù)反饋關(guān)系，對(duì)于調(diào)節(jié)NK細(xì)胞分化和功能具有重要影響。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)都證明抑制FCGR3在小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞（USCs）的活性、凋亡以及影響子宮內(nèi)膜異位病程發(fā)展等方面都與抑制PTGS2有著截然相反的效果。將PTGS2基因敲除小鼠的NK細(xì)胞注射到EMS小鼠模型中后，子宮內(nèi)膜異位的程度顯著緩解（Fig12）。說明自噬和HCK途徑被抑制后，PTGS2^highFCGR3^- NK細(xì)胞會(huì)促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位的發(fā)展。

Fig11 PTGS2⁺ FCGR3^- NK cells present low levels of PRF1, GZMB and IFNG

Fig12 PTGS2^highFCGR3^- NK cells accelerate the growth of ectopic lesion and progression of EMS.

該研究不僅闡述了自噬與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系，還提示了PTGS2抑制劑作為子宮內(nèi)膜異位癥治療藥物的潛能，為治療NK細(xì)胞功能不足相關(guān)疾病的治療提供了新的思路。