基因修飾小鼠（GEM）模型在腫瘤學(xué)研究中的應(yīng)用

作者：俞曉峰 博士 賽業(yè)模式動(dòng)物高級(jí)副總裁、高級(jí)科學(xué)家 

前沿

相對(duì)于過去常用的腫瘤細(xì)胞接種和免疫缺陷小鼠模型，基因修飾小鼠（GEM）模型是建立在天然完整免疫條件下的原發(fā)（de novo）腫瘤。因此，作為腫瘤學(xué)研究的工具，GEM模型更能模擬人腫瘤的組織病理學(xué)和分子學(xué)特征，表現(xiàn)為有更好的遺傳異質(zhì)性，其優(yōu)勢(shì)在于能反映腫瘤細(xì)胞自身，以及腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞等相互作用因素，包括具有引起原發(fā)腫瘤開始形成到發(fā)展為轉(zhuǎn)移性疾病的能力。GEM模型的建立及應(yīng)用極大促進(jìn)了腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展與進(jìn)步。目前，GEM模型已成功應(yīng)用于驗(yàn)證潛在腫瘤基因與藥物靶點(diǎn)，考核治療效果，分析腫瘤微環(huán)境影響，以及評(píng)價(jià)藥物耐藥性機(jī)制等研究領(lǐng)域。而且，結(jié)合臨床病人研究與構(gòu)建更加合理有效的GEM模型，優(yōu)化腫瘤干預(yù)的臨床前試驗(yàn)，無(wú)疑將進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤治療新策略的研發(fā)，提高其有效轉(zhuǎn)化為臨床上實(shí)際應(yīng)用的成功率。

目前腫瘤學(xué)研究面臨的主要挑戰(zhàn)

腫瘤學(xué)研究及腫瘤治療在臨床上仍然面臨著許多挑戰(zhàn)，其中抗腫瘤藥物耐受性的形成和腫瘤轉(zhuǎn)移性疾病是當(dāng)前面臨的兩個(gè)重要現(xiàn)實(shí)難題�？鼓[瘤耐藥性的產(chǎn)生是由于異質(zhì)性腫瘤中的原發(fā)突變的出現(xiàn)，或治療前耐藥克隆的大量生長(zhǎng)引起的，而現(xiàn)有靶向抗腫瘤制劑的單一療法，或化學(xué)藥物療法都無(wú)法避免藥物耐受的發(fā)生。而且，在獲得明顯成功治療之后，少量藥物耐受腫瘤細(xì)胞可以存活下來，并在一定時(shí)間后，成為主要細(xì)胞群，最終形成與原始腫瘤表型不同的復(fù)發(fā)疾病。而腫瘤轉(zhuǎn)移性疾病則是導(dǎo)致90%以上與癌癥相關(guān)死亡的原因，因?yàn)楝F(xiàn)在對(duì)于這些繼發(fā)腫瘤也多無(wú)有效的治療方法。近年來，雖然針對(duì)干預(yù)腫瘤病人免疫系統(tǒng)的腫瘤免疫療法取得了一些令人鼓舞的進(jìn)展，但該療法也只是在一些特定病例情況下有效果，而對(duì)于大多數(shù)腫瘤病人仍不具有實(shí)際臨床意義。

所謂成功的腫瘤治療往往需要多種方法的協(xié)同作用，比如手術(shù)，放射線照射，細(xì)胞毒性療法，以及免疫療法等綜合策略。為了設(shè)計(jì)出有效合理的綜合治療措施與方案，首要的基礎(chǔ)與前提是深入了解腫瘤的形成與發(fā)展，轉(zhuǎn)移，及治療應(yīng)答過程中，腫瘤細(xì)胞自身及其微環(huán)境細(xì)胞間相互作用的機(jī)制，從而尋找針對(duì)不同腫瘤類型最有效的治療方法。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，研究者們就必須依賴于動(dòng)物模型的臨床前研究。盡管過去依賴于傳統(tǒng)臨床前小鼠模型（即通過建立移植人腫瘤細(xì)胞系或同種小鼠腫瘤細(xì)胞系模型等方法）獲得了臨床前抗癌新療法的成功驗(yàn)證，但絕大多數(shù)的這些新療法在臨床III期試驗(yàn)中卻都以失敗而告終。

總體上講，由于傳統(tǒng)體內(nèi)腫瘤小鼠模型在預(yù)測(cè)臨床新療法效果方面的表現(xiàn)不佳，因而更加凸顯出尋找具有更好預(yù)測(cè)能力及效果的改進(jìn)型臨床前體內(nèi)模型的意義與價(jià)值。最近在基因修飾技術(shù)方面的進(jìn)步與發(fā)展，使得快速研制能更有效模擬人腫瘤的GEM模型成為現(xiàn)實(shí)，GEM模型在遺傳組成，腫瘤細(xì)胞與其腫瘤微環(huán)境的相互作用，藥物反應(yīng)及耐受等方面都更接近腫瘤病人。而新一代GEM模型的出現(xiàn)，也大大促進(jìn)抗腫瘤新療法策略轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，最終達(dá)到提高癌癥病人生存率的目的。

腫瘤學(xué)研究中常用傳統(tǒng)小鼠模型的優(yōu)勢(shì)與不足

50年前首先在裸鼠體內(nèi)移植人/鼠腫瘤細(xì)胞系而建立的小鼠腫瘤移植模型成為腫瘤研究中常用的小鼠模型，這類移植模型可快速測(cè)試潛在腫瘤及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，并成為臨床前的藥物試驗(yàn)主要工具。例如，通過異種移植研究有助于揭示結(jié)腸癌（CRC）對(duì)藥物（如Vemurafenib）在小鼠體內(nèi)的耐受機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)在臨床試驗(yàn)中對(duì)CRC病人啟動(dòng)同時(shí)針對(duì)突變BRAF（如V600E）和EGFR的靶向聯(lián)合療法，表明這類異種移植模型在建立新的聯(lián)合治療策略方面的實(shí)際意義。

異種移植研究也有助于發(fā)現(xiàn)特定基因表達(dá)特征，研究其介導(dǎo)的器官特異性定位轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。如應(yīng)用該種模型證實(shí)了傳播的乳腺癌細(xì)胞存在于血管附近，這為調(diào)控這些傳播的乳腺癌細(xì)胞提供了可能的對(duì)策。而且，應(yīng)用腫瘤細(xì)胞系移植的體內(nèi)模型研究，也為抗腫瘤免疫，T細(xì)胞耐受機(jī)制，腫瘤免疫逃逸途徑等提供了許多基本的認(rèn)識(shí)概念。這些發(fā)現(xiàn)都為目前進(jìn)行中的腫瘤免疫療法的突破奠定了基礎(chǔ)。

然而，由于腫瘤細(xì)胞系一開始就含有許多突變，而且在體外長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過程中，還會(huì)產(chǎn)生額外突變，因此，此類接種模型難以真實(shí)反映人腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和遺傳異質(zhì)性，從而降低了該類模型作為臨床應(yīng)用效果預(yù)測(cè)性的可靠性。另外，為了防止可能的排斥反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞系的異種移植模型是建立在免疫缺陷小鼠基礎(chǔ)上，這也限制了其應(yīng)用于腫瘤發(fā)展中免疫系統(tǒng)以及治療應(yīng)答等領(lǐng)域的研究。

不同于細(xì)胞系移植模型，通過將新鮮人腫瘤活檢物移植至免疫缺陷小鼠構(gòu)建的病人來源的腫瘤移植（Patient-derived tumor xenografts，PDTX，或PDX）模型則具有更多優(yōu)勢(shì)，PDX小鼠模型的腫瘤保留了來自腫瘤病人的腫瘤組織分子，遺傳，組織學(xué)異質(zhì)性等特征（甚至經(jīng)過小鼠體內(nèi)的傳代幾代之后）。所以，PDX模型也成為目前個(gè)性化醫(yī)學(xué)和臨床前藥物篩選的有用工具。 

目前，PDX模型的研究已大規(guī)模應(yīng)用于潛在臨床藥物預(yù)測(cè)試驗(yàn)。有研究者通過構(gòu)建約1000個(gè)來自不同類型突變的PDX模型，并應(yīng)用這些不同的PDX模型對(duì)不同藥物進(jìn)行小鼠體內(nèi)篩選，尋找藥物與腫瘤基因型之間的關(guān)聯(lián)性，以達(dá)到試驗(yàn)重復(fù)性和臨床可解釋性的統(tǒng)一。

不幸的是，PDX模型在研究某些類型腫瘤方面（如雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌和前列腺癌）的不滿意效果成為了限制其應(yīng)用的主要障礙。而且，PDX模型必須建立在免疫缺陷小鼠上，這樣的小鼠缺乏由獲得性免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的天然抗腫瘤與促腫瘤活動(dòng)。

研究者們也明白，雖然PDX模型缺乏功能性的獲得性免疫系統(tǒng)，該模型仍可為臨床提供有價(jià)值的研究資料。正在進(jìn)行中的相應(yīng)改進(jìn)是通過移植人CD34陽(yáng)性造血干細(xì)胞或前體細(xì)胞的方法，重建人免疫系統(tǒng)的人源化的小鼠模型，并取得了顯著的成功。雖然來自某些特異譜系的人免疫細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的重建仍具有挑戰(zhàn)性，但通過引入人相關(guān)細(xì)胞因子，趨化因子，生長(zhǎng)因子等方式，獲得促進(jìn)人骨髓細(xì)胞在小鼠體內(nèi)發(fā)育與成熟的效果。

為了構(gòu)建優(yōu)化能夠支持人HLA限制性T細(xì)胞發(fā)育的免疫缺陷小鼠，應(yīng)用基因修飾技術(shù)建立人源化小鼠模型，將人HLA分子引入至敲除小鼠MHC類型I和II相應(yīng)區(qū)域。人源化小鼠模型能作為免疫療法臨床前評(píng)價(jià)的有用工具，然而，當(dāng)人造血干細(xì)胞供體來源（如通過臍帶血或胎肝）有限時(shí)，其現(xiàn)實(shí)操作中的較高構(gòu)建成本也自然成為該模型實(shí)際應(yīng)用的不利因素了。

應(yīng)用不斷完善GEM模型研究原發(fā)腫瘤

上世紀(jì)70年代成功建立小鼠原核注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)以后，1980年早期借助該方法第一次將克隆癌基因?qū)�入小鼠基因組中，成功制備了所謂的致癌小鼠（Oncomice）。 該致癌小鼠是應(yīng)用乳腺特異性起動(dòng)子（MMTV）特異性表達(dá)癌基因v-HRas的第一個(gè)腫瘤GEM模型，該致癌小鼠首次構(gòu)建成功，證實(shí)了該小鼠形成原發(fā)乳腺腫瘤，并極大地振奮了腫瘤研究領(lǐng)域團(tuán)體，因?yàn)榇搜芯拷Y(jié)果第一次真正證明了癌基因在正常細(xì)胞中表達(dá)能產(chǎn)生腫瘤的假說。1992年伴隨著小鼠胚胎干細(xì)胞（ES）基因打靶技術(shù)的突破發(fā)展，成功構(gòu)建的腫瘤抑制基因（TSG）敲除小鼠，也證明了該類TSG基因在腫瘤發(fā)生過程中的重要作用。

雖然致癌小鼠和TSG敲除小鼠提供了非常有價(jià)值的理論依據(jù)，但這兩種模型也存在其局限性。由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的小鼠是使轉(zhuǎn)入的外源基因表達(dá)在特定組織中所有的細(xì)胞，TSG敲除小鼠則是滅活體內(nèi)所有細(xì)胞中的相關(guān)基因。然而，現(xiàn)實(shí)腫瘤的形成過程是在個(gè)體中整個(gè)組織器官健康的前提下，由于某個(gè)單細(xì)胞中某種遺傳變異的積累而導(dǎo)致的彌散腫瘤現(xiàn)象。為了符合腫瘤形成過程的實(shí)際情況，更有必要設(shè)計(jì)與構(gòu)建更加合理或復(fù)雜的小鼠模型，比如能實(shí)現(xiàn)條件性的在體細(xì)胞滅活腫瘤抑制基因，或者激活（突變）致癌基因的所謂條件性GEM模型。條件性GEM模型構(gòu)建的基本原理是將需要修飾基因兩端分別加上loxP重組位點(diǎn)，在特定Cre重組酶存在的情況下，loxP兩端之間的DNA就可被敲除，達(dá)到特定條件下滅活該基因的目的。應(yīng)用這種模型的第一個(gè)成功的例子是應(yīng)用Cre-loxP系統(tǒng)介導(dǎo)的體細(xì)胞滅活A(yù)pc基因而構(gòu)建的小鼠結(jié)直腸癌模型。應(yīng)用腺病毒載體實(shí)現(xiàn)Cre重組酶特異性表達(dá)于腸上皮細(xì)胞，組織特異性敲除APC基因，引起小鼠快速形成散在結(jié)直腸腺瘤，其特征與家族性結(jié)腸腺瘤性息肉�。‵AP）病人有許多相似性。所以，通過發(fā)現(xiàn)特異性相關(guān)癌癥基因的突變體，研究者們可構(gòu)建在組織學(xué)、分子學(xué)以及臨床上更能模擬腫瘤病人的相似特征的小鼠模型。

借助Cre-ERT融合蛋白誘導(dǎo)系統(tǒng)，研究者們可對(duì)體細(xì)胞中相關(guān)靶基因在特定時(shí)間與特定組織實(shí)施修飾，即將雌激素受體的突變激素結(jié)合區(qū)域與Cre重組酶融合在一起，建立可誘導(dǎo)調(diào)控的Cre重組酶表達(dá)系統(tǒng)，當(dāng)在雌激素類似物（如Tamoxifen）存在的情況下，引起Cre重組酶活性在翻譯后激活，發(fā)揮其識(shí)別loxP位點(diǎn)的作用，實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)性切割靶基因的目的。因此，LoxP小鼠（即靶基因DNA兩端分別含loxP位點(diǎn)）的條件性基因修飾，通過在選擇的時(shí)間里加入誘導(dǎo)劑Tamoxifen后，控制Cre-ERT的特異性表達(dá)，達(dá)到對(duì)靶基因進(jìn)行時(shí)空與區(qū)域上特定修飾的目的。

雖然Cre-loxP系統(tǒng)能用于多于一個(gè)基因的修飾，但因這種過程是同時(shí)發(fā)生的，所以難以完全模擬腫瘤多步驟形成過程中，突變是逐漸積累形成過程的特征。最近，研究者們利用可獨(dú)立發(fā)揮作用的可誘導(dǎo)雙重組酶系統(tǒng)（如Flp-FRT/Cre-loxP，或Cre-loxP/Dre-rox），建立了對(duì)靶基因表達(dá)實(shí)施先后調(diào)控的修飾方式。該技術(shù)方法成功應(yīng)用的實(shí)際意義有如下幾方面，1. 獨(dú)立研究針對(duì)腫瘤細(xì)胞的自發(fā)和非自發(fā)通路及過程；2.  模擬人多步驟的癌癥形成過程，有續(xù)地進(jìn)行誘導(dǎo)突變；3. 開展獨(dú)特的腫瘤治療靶點(diǎn)遺傳性評(píng)價(jià)。

腫瘤GEM模型構(gòu)建策略與技術(shù)方面的改進(jìn)

GEM模型因其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)已經(jīng)被證實(shí)是腫瘤學(xué)研究的有效工具，但研究者們也一直努力對(duì)其進(jìn)行著不斷改進(jìn)與完善。該類小鼠模型由于在構(gòu)建與研制過程中周期長(zhǎng)，工作量大，以及成本高等原因，特別是對(duì)于多個(gè)等位遺傳位點(diǎn)進(jìn)行修飾，構(gòu)建具有遺傳特性的新突變小鼠模型，研制過程更耗時(shí)，且需要更長(zhǎng)久的交配繁殖過程。這也成為限制具有遺傳能力的GEM模型廣泛實(shí)際應(yīng)用的一個(gè)主要因素。近年來，由于腫瘤基因組序列研究技術(shù)的廣泛普及與應(yīng)用，以及隨著新發(fā)現(xiàn)的癌癥相關(guān)基因突變數(shù)量的快速增長(zhǎng)，更加需要建立快速新穎的小鼠模型研制策略，實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)快速驗(yàn)證潛在致癌基因，以及建立已知病人相關(guān)突變的非生殖遺傳修飾GEM模型的目的。目前這方面的進(jìn)展主要有：ES細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤模型；應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)基因組編程；腫瘤病人相關(guān)位點(diǎn)的改善腫瘤模型。

 

1. ES細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤模型

為了進(jìn)一步加快新型人腫瘤GEM模型的研制，將小鼠胚胎干細(xì)胞（ESC）經(jīng)過基因修飾后而作為非遺傳修飾（如嵌合體）小鼠直接進(jìn)行腫瘤學(xué)研究已成為一種研究策略。最近報(bào)道的GEM-ESC策略，即建立以ES細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤GEM模型。該類模型是在原有基因修飾的基礎(chǔ)上，快速構(gòu)建新型基因遺傳修飾小鼠模型。例如，應(yīng)用GEM-ESC策略，在原有K14cre-Brca1-Trp53(KBIP)的小鼠乳腺腫瘤模型的ESC上，直接導(dǎo)入MET原癌基因，構(gòu)建新型KBIP-MET的轉(zhuǎn)化乳腺癌模型。研究結(jié)果表明，與KBIP小鼠相比，此KBIP-MET小鼠形成的乳腺癌更具有轉(zhuǎn)化特征，表現(xiàn)為更容易形成癌肉瘤。在對(duì)腫瘤藥物的反應(yīng)性上，KBIP小鼠模型的乳腺癌對(duì)臨床RARP抑制劑（如Olaparib）敏感，而KBIP-MET小鼠模型的轉(zhuǎn)化乳腺腫瘤則顯示對(duì)該抑制劑具有耐受性。

2. 應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)的基因組編程

過去十年，伴隨新的基因組編程技術(shù)（如ZFNs和TALENs）快速發(fā)展，2013年出現(xiàn)CRISPR/Cas9基因組編程系統(tǒng)，該類基因組編輯技術(shù)成為繼PCR技術(shù)發(fā)展以來，過去幾年生物學(xué)研究領(lǐng)域的有革命性進(jìn)步的及影響力最大的技術(shù)更新。CRISPR/Cas9系統(tǒng)首先發(fā)現(xiàn)于原核生物中針對(duì)抵抗外來入侵遺傳物質(zhì)而建立的免疫系統(tǒng)，并很快被成功用于各類物種的基因編輯。借助單一的引導(dǎo)RNA（sgRNAs)，Cas9核酸酶成為能特異性作用于基因組任何基因位點(diǎn)，達(dá)到基因敲除的目的。通過應(yīng)用Cas9誘導(dǎo)的DNA斷裂和單鏈核苷酸/供體DNA，該系統(tǒng)也可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因突變，或特定插入loxP/FRT重組位點(diǎn)等進(jìn)行遺傳修飾。

CRISPR/Cas9技術(shù)系統(tǒng)所表現(xiàn)出的同時(shí)對(duì)基因組不同位點(diǎn)進(jìn)行有效編輯等基因打靶策略特征，使其立刻成為快速研制腫瘤小鼠模型的最佳選擇。目前在人腫瘤病人觀察的所有遺傳突變都可以通過基因修飾的方法來快速地構(gòu)建相應(yīng)的小鼠模型，包括條件性基因敲除，點(diǎn)突變，易位等。另外，也有研究者應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)小鼠的致癌基因和TSGs進(jìn)行了體細(xì)胞（非生殖遺傳性）編輯，因?yàn)榇搜芯坎呗缘呐�力與成功，使該系統(tǒng)成為研制肝細(xì)胞腫瘤，肺癌，腦癌，胰腺癌，以及乳腺癌的非遺傳修飾模型的新方法。

最近，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也應(yīng)用于靶基因的抑制（CRISPRi）或激活（CRISPRa)的遺傳修飾。這類修飾系統(tǒng)可用于研制相應(yīng)致癌基因，和/或抑制TSGs基因的誘導(dǎo)和可逆激活小鼠模型。比如借助CRISPRa為基礎(chǔ)的系統(tǒng)，通過激活致癌基因的轉(zhuǎn)錄，達(dá)到研究其致癌潛力的目的。

雖然CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的基因編輯系統(tǒng)非常具有潛力，但該系統(tǒng)應(yīng)用于體內(nèi)基因編輯也存在一定的缺陷，比如，目前該系統(tǒng)策略不適合于驗(yàn)證潛在致癌基因的致癌潛力。另外，將Cas9導(dǎo)入體細(xì)胞的基因編輯方式，可引起Cas9特異性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致Cas9表達(dá)細(xì)胞有被清除的可能性。為了避免這些可能的潛在風(fēng)險(xiǎn)，可選擇在免疫缺陷小鼠體內(nèi)進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，或通過基因修飾方法，首先獲得對(duì)Cas9具有免疫學(xué)耐受小鼠模型后，再開展相應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。最后，雖然已有報(bào)道表明，應(yīng)用引起DNA單鏈斷開的可誘導(dǎo)Cas9n缺口酶，可以降低其脫靶效應(yīng)， 但研究者在實(shí)際應(yīng)用中必須有清晰認(rèn)識(shí)，要想完全避免由CRISPR/Cas9介導(dǎo)的非設(shè)計(jì)所需要的脫靶突變是很難的。

3. 腫瘤病人相關(guān)位點(diǎn)的改善腫瘤模型

構(gòu)建理想的腫瘤病人相關(guān)突變模型，對(duì)研究靶基因在腫瘤發(fā)生過程中的作用，以及有效評(píng)價(jià)藥物效應(yīng)就顯得很有必要性與實(shí)際意義。因?yàn)樵谌四[瘤抑制基因（TSGs）中，許多具有腫瘤形成依賴的生殖細(xì)胞突變和體細(xì)胞突變都是錯(cuò)義或無(wú)義突變，從而導(dǎo)致突變產(chǎn)物或可能帶有功能截短蛋白的形成。這類突變現(xiàn)象是難以通過條件性敲除小鼠模型來實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)闂l件性基因修飾策略是將靶基因中某個(gè)或幾個(gè)外顯子完全敲除，達(dá)到滅活靶基因功能。一些研究結(jié)果已經(jīng)表明，參照腫瘤病人相關(guān)TSG突變構(gòu)建的小鼠突變模型，可產(chǎn)生與靶基因完全敲除不同的表型。比如，與Trp53基因敲除小鼠比較，病人相關(guān)的Trp53熱點(diǎn)突變小鼠表現(xiàn)有更加明顯的致癌活性。

同樣，構(gòu)建BRCA1乳腺癌病人相關(guān)的Brca1基因突變的條件性小鼠模型研究表明，與Brac1完全敲除小鼠模型相比，因Brac1基因中特定RING區(qū)域引入突變而引起的乳腺腫瘤，更容易對(duì)那些破壞DNA的藥物產(chǎn)生耐受性，因?yàn)槠銪RCA1蛋白含有較少的RING活性的緣故。研究也證實(shí)，由于突變導(dǎo)致Brac1蛋白含有較少的RING活性 ，表現(xiàn)為更容易對(duì)那些破壞DNA的藥物產(chǎn)生耐受性，該結(jié)果有助于揭示這些突變與治療反應(yīng)效果之間的因果關(guān)系。

GEM模型在腫瘤學(xué)研究中的應(yīng)用范圍

作為原發(fā)腫瘤發(fā)生的GEM模型，可成為體內(nèi)分析包括腫瘤形成，發(fā)展及轉(zhuǎn)移中腫瘤形成等過程中細(xì)胞本身與細(xì)胞間相互作用的系統(tǒng)選擇。人腫瘤GEM模型也已成功應(yīng)用于驗(yàn)證候選藥物靶點(diǎn)，評(píng)估治療效果，以及評(píng)價(jià)藥物耐受機(jī)制等方面。由于GEM模型是在具有完整免疫系統(tǒng)的小鼠體內(nèi)形成原發(fā)腫瘤，因此，該類模型更適合潛在腫瘤免疫治療的探索性研究。建立基因修飾小鼠模型與人疾病緊密相關(guān)性研究的策略與方法，為探索與開發(fā)腫瘤治療新方法與策略提供了有意義的應(yīng)用平臺(tái)。也為設(shè)計(jì)和開發(fā)新抗腫瘤治療，提供了臨床治療效果等相關(guān)信息。GEM模型在以下幾個(gè)方面對(duì)腫瘤生物學(xué)及轉(zhuǎn)化腫瘤學(xué)等研究進(jìn)展及貢獻(xiàn)中發(fā)揮了重要作用。

1. 驗(yàn)證潛在癌基因

在大量腫瘤樣品測(cè)序研究獲得不斷增加的潛在腫瘤基因基礎(chǔ)上，建立體內(nèi)快速驗(yàn)證這些潛在腫瘤相關(guān)基因的策略是非常必要和有實(shí)際意義的�？紤]到速度和相對(duì)簡(jiǎn)單化因素，GEM-ESC和CRISPR/Cas9技術(shù)可作為快速驗(yàn)證潛在腫瘤基因的首選方法。特別是應(yīng)用基于體細(xì)胞的CRIPPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，建立非遺傳修飾的小鼠模型，實(shí)現(xiàn)高通量體內(nèi)驗(yàn)證潛在腫瘤基因的目的。比如，應(yīng)用DNA注射與活體電穿孔相結(jié)合的轉(zhuǎn)染方法，將引起胰腺管腺癌（PDAC）的13個(gè)不同的主要腫瘤抑制相關(guān)基因的15個(gè)gRNAs/Cas9表達(dá)質(zhì)粒混合物一起導(dǎo)入成熟小鼠的胰腺，構(gòu)建同時(shí)修飾此13個(gè)基因的小鼠模型。結(jié)果顯示，此PDAC小鼠有超過60%的這些靶基因顯示基因敲除，提示CRISPR/Cas9介導(dǎo)的突變誘發(fā)了腫瘤的形成。同樣，利用Dox誘導(dǎo)Cas9表達(dá)的GEM模型也被用于驗(yàn)證已知的多種腸道腫瘤基因（如Apc和Trp53）。除了修飾TSGs, CRISPR/Cas9技術(shù)還應(yīng)用于驗(yàn)證染色體重排的致癌性，如在肺癌病人觀察到的Eml4-Alk基因的融合現(xiàn)象。

另外，應(yīng)用GEM模型對(duì)來自臨床病人并篩選獲得的候選潛在癌基因進(jìn)行驗(yàn)證，也已成為研究腫瘤相關(guān)基因功能的常用策略。例如，最近胡卓偉教授課題組通過構(gòu)建條件性過表達(dá)和敲除GEM模型，研究假激酶Trib3基因在促進(jìn)急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL）形成中的作用，結(jié)果表明，同時(shí)在小鼠骨髓細(xì)胞中特異性表達(dá)或敲除Trib3與 致癌蛋白PML-RARa (PR) 融合基因，Trib3基因可顯著增加PR誘發(fā)APL形成的作用。而呂毅教授課題組則是通過構(gòu)建Y染色體性別決定區(qū)（Sry) 基因特異性表達(dá)的GEM模型，首次證實(shí)了在肝組織內(nèi)特異性過表達(dá)Sry基因雄/雌小鼠對(duì)化學(xué)致癌劑（DEN）誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞癌（HCC）形成更加敏感，提示Sry基因在HCC形成過程中發(fā)揮了重要的促進(jìn)作用。

2. 研究致癌基因的依賴性

致癌基因依賴現(xiàn)象是指某些腫瘤形成完全依賴于單一致癌基因。由于條件性GEM模型對(duì)基因的修飾是不可逆的，因而不適合研究致癌基因依賴性。因此需要選擇不同的調(diào)控誘導(dǎo)策略進(jìn)行相應(yīng)的研究，例如將致癌基因與ERT融合達(dá)到控制其表達(dá)的目的。有研究報(bào)道，將Trp53-ERT變異體取代內(nèi)源Trp53建立的純合敲入小鼠，該Trp53-ERT小鼠只有在Tamoxifen存在條件下，誘導(dǎo)Trp53的表達(dá)，并在已形成腫瘤小鼠模型的基礎(chǔ)上，研究再恢復(fù)p53功能后對(duì)已有腫瘤的影響。研究結(jié)果表明，在Eu-Myc引起的淋巴瘤基礎(chǔ)上，恢復(fù)Trp53活性可產(chǎn)生快速細(xì)胞凋亡，明顯增加小鼠的存活率。另外，多西霉素（Doxycycline，Dox）調(diào)控基因表達(dá)的可逆誘導(dǎo)系統(tǒng)也被應(yīng)用于GEM模型的建立，通過該系統(tǒng)誘導(dǎo)人MYC原癌基因的表達(dá)后，引起腫瘤的形成。在關(guān)閉MYC基因表達(dá)后觀察，導(dǎo)致原癌基因失活后，已形成的腫瘤的相應(yīng)反應(yīng)。該研究是應(yīng)用Dox的Tet-off誘導(dǎo)系統(tǒng)，持續(xù)在小鼠造血干細(xì)胞中特異表達(dá)人MYC轉(zhuǎn)基因，誘導(dǎo)小鼠形成惡性T細(xì)胞淋巴瘤和急性髓系白血病，在此基礎(chǔ)上，如果通過添加Dox誘導(dǎo)劑使MYC表達(dá)停止后，發(fā)現(xiàn)已表現(xiàn)出的腫瘤表型也隨之消弱，并證實(shí)此過程與腫瘤細(xì)胞周期死亡有關(guān)。研究也發(fā)現(xiàn)，對(duì)于此可逆誘導(dǎo)系統(tǒng)中停止激活MYC表達(dá)后的長(zhǎng)期效果，不同的腫瘤類型是有區(qū)別的。如在骨肉瘤中短暫抑制MYC表達(dá)，因?yàn)槿饬黾?xì)胞分化為成熟的骨細(xì)胞，所以會(huì)出現(xiàn)肉瘤持續(xù)萎縮的現(xiàn)象。相反，雖然MYC表達(dá)抑制會(huì)引起肝癌出現(xiàn)彌漫性的萎縮，但是，存留的腫瘤細(xì)胞仍處于潛伏狀態(tài)，并在重新開啟MYC表達(dá)后，可以很快恢復(fù)其腫瘤特征。

3. 破解自發(fā)性轉(zhuǎn)移形成機(jī)制

盡管有不斷改善的腫瘤治療選擇策略，轉(zhuǎn)移疾病仍然是引起癌癥死亡的主要原因。轉(zhuǎn)移過程是通過腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境相互持續(xù)作用而形成的復(fù)雜的多步驟過程。過去絕大多數(shù)的臨床前轉(zhuǎn)移研究是借助細(xì)胞系接種模型來實(shí)施的，而這類模型不能真實(shí)反映腫瘤病人的轉(zhuǎn)移過程。GEM模型可引起原發(fā)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移形成，因而是研究過去未知的腫瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移形成過程不可缺少的工具。由于原發(fā)腫瘤的過度生長(zhǎng)，在大范圍轉(zhuǎn)移形成之前，小鼠一般不得不被處死，這也是GEM模型潛在的不足之處。這一局限可以通過將GEM來源的腫瘤組織進(jìn)行原位移植的方式解決，比如通過手術(shù)移植方式，達(dá)到保留供體腫瘤的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性效果，使其轉(zhuǎn)移過程的發(fā)生接近臨床上的常見轉(zhuǎn)移疾病。

應(yīng)用GEM模型研究腫瘤轉(zhuǎn)移過程已獲得了某些重要的發(fā)現(xiàn)。過去的研究認(rèn)為腫瘤轉(zhuǎn)移是發(fā)生在腫瘤形成過程晚期。然而，通過BALB-NeuT和MMTV-PyMT小鼠乳腺腫瘤模型的研究表明，來自早期的損傷轉(zhuǎn)染細(xì)胞已經(jīng)具有傳播至骨髓和肺組織而形成微小轉(zhuǎn)移瘤的能力。另外，上皮細(xì)胞至間葉細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移（EMT）被認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞傳播和轉(zhuǎn)移方面起到了非常重要的作用。然而，應(yīng)用胰腺癌和乳腺癌GEM模型的研究表明，腫瘤細(xì)胞不僅保留了其上皮細(xì)胞特征，卻還能在轉(zhuǎn)移病灶位置出現(xiàn)，提示EMT在這些模型中的腫瘤轉(zhuǎn)移形成并不是必須的。再有，在探索腫瘤轉(zhuǎn)移形成過程中，腫瘤細(xì)胞與免疫系統(tǒng)之間復(fù)雜關(guān)聯(lián)方面，GEM模型明顯發(fā)揮了突出的關(guān)鍵作用。例如，骨髓免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，在促進(jìn)不同種癌癥的轉(zhuǎn)移形成方面，起到了至關(guān)重要的作用。最近有研究報(bào)道表明，乳腺腫瘤引起系統(tǒng)炎癥，即由IL17-產(chǎn)生的T細(xì)胞及繼發(fā)的免疫抑制中性粒細(xì)胞的擴(kuò)增，可引發(fā)小葉乳腺癌GEM模型的自發(fā)性轉(zhuǎn)移形成，導(dǎo)致GEM移植模型的自發(fā)轉(zhuǎn)移疾病。

GEM模型在揭示相關(guān)基因參與抑制腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制方面也發(fā)揮了重要作用。最近，劉寶華課題組應(yīng)用Tet-ON可誘導(dǎo)Sirt7表達(dá)的GEM模型，揭示了Sirt7抑制原發(fā)胰腺癌轉(zhuǎn)移作用機(jī)制，該研究結(jié)果證實(shí)，由Dox誘導(dǎo)表達(dá)的Sirt7具有明顯抑制MMTV-PyMT小鼠乳腺腫瘤肺轉(zhuǎn)移的作用，且其作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

因此，GEM模型在揭示腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)雜性，挑戰(zhàn)當(dāng)下普遍接受的理論(即腫瘤轉(zhuǎn)移是晚期癌癥細(xì)胞包括EMT在內(nèi)的轉(zhuǎn)移過程)等方面，都發(fā)揮了不可缺少的作用。這些重要的發(fā)現(xiàn)有可能為轉(zhuǎn)移癌癥病人的治療提供重要的參考依據(jù)。

4. 研究腫瘤微環(huán)境作用

在揭示腫瘤細(xì)胞外部因子（如癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs) 和免疫細(xì)胞）如癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs) 和免疫細(xì)胞與腫瘤形成過程等作用方面，GEM模型已發(fā)揮了不可取代的作用。CAFs可通過合成細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分（如膠原蛋白，纖維連接蛋白，層粘連蛋白）來調(diào)控ECM和基底膜形成。而且，CAFs是各種可溶性介導(dǎo)物包括基體金屬蛋白酶（MMPs)的來源, 在促使ECM轉(zhuǎn)化，加強(qiáng)其在維持ECM動(dòng)態(tài)平衡方面有著重要作用。GEM模型研究已表明，CAFs在腫瘤形成過程中具有雙重作用。利用K4-HPV6鱗狀皮膚癌小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，在上皮細(xì)胞惡性癌轉(zhuǎn)化過程中，CAFs能通過增強(qiáng)炎癥，血管形成，以及ECM重新組成，從而刺激腫瘤的發(fā)展。

相反，通過兩個(gè)獨(dú)立的胰腺癌GEM模型的研究表明，在體內(nèi)抑制CAFs具有加速腫瘤形成過程的效果，提示CAFs對(duì)腫瘤的阻止作用。如此相互矛盾的現(xiàn)象對(duì)于免疫細(xì)胞來說則是可以理解的，起初免疫細(xì)胞被認(rèn)為是可通過攻擊轉(zhuǎn)化腫瘤的細(xì)胞，抑制腫瘤形成過程。然而，最近的研究表明，這些免疫細(xì)胞也具有促進(jìn)腫瘤的功能。應(yīng)用小鼠模型對(duì)一些不同的腫瘤類型的研究已揭示了炎癥與腫瘤之間的相互關(guān)系。例如，應(yīng)用大腸炎相關(guān)癌癥的小鼠模型，在髓系免疫細(xì)胞中特異性敲除NF-jB信號(hào)系統(tǒng)后，減緩小鼠腫瘤生長(zhǎng)，表明其具有促進(jìn)腫瘤的作用。

另外，K4-HPV6小鼠模型研究也表明，肥大細(xì)胞與骨髓來源細(xì)胞借助MMP9激活血管生成和重新調(diào)整基質(zhì)結(jié)構(gòu)等方式，發(fā)揮其促進(jìn)鱗狀皮膚癌形成作用。應(yīng)用同樣的皮膚癌癥模型發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥有促進(jìn)新生腫瘤形成的作用。至此，人們已經(jīng)開始對(duì)炎癥誘導(dǎo)腫瘤的相關(guān)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的促進(jìn)作用進(jìn)行研究。例如，在MMTV-PyMT乳腺癌小鼠模型基礎(chǔ)上，將一種重要的巨噬細(xì)胞相關(guān)基因CSF1 （Colony-stimulating factor1 ）敲除后發(fā)現(xiàn)，該小鼠的乳腺腫瘤惡性化過程被延緩。同樣，抑制CXCR2（一種介導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移的趨化因子）則有抑制APC小鼠的腸道腫瘤形成的效果�？傊�，這些研究強(qiáng)調(diào)了免疫細(xì)胞在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中，發(fā)揮了協(xié)同參與調(diào)控的作用。

5. 確定腫瘤細(xì)胞的來源

揭示腫瘤發(fā)生過程中的細(xì)胞來源將為開發(fā)與改善治療策略提供非常重要的理論基礎(chǔ)。應(yīng)用GEM模型已經(jīng)成功闡明了某些不同腫瘤類型的細(xì)胞起源。在小細(xì)胞肺癌（SCLC）研究中，通過氣管內(nèi)注射細(xì)胞特異性的Adeno-Cre病毒載體，使Trp53和Rb1兩基因分別在Clara細(xì)胞, 神經(jīng)內(nèi)分泌的（NE）細(xì)胞，以及II型肺泡（SPC）細(xì)胞被特異性敲除，分析腫瘤發(fā)生的不同時(shí)間和腫瘤表型等。結(jié)果表明，相對(duì)于SPC細(xì)胞，NE細(xì)胞是造成SCLC形成的主要細(xì)胞來源。另外，細(xì)胞來源的研究也能提供與以前研究結(jié)果不一樣的意外結(jié)果。比如，過去以BRCA1為基礎(chǔ)的乳腺癌研究認(rèn)為，該類癌癥的來源細(xì)胞是基底上皮干細(xì)胞。而在應(yīng)用GEM模型對(duì)BRCA1引起的基底樣乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，其實(shí)管腔祖細(xì)胞才是基底樣腫瘤的真正來源。

最近來自兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，遺傳變異（如Pik3ca突變）可顯著地影響干細(xì)胞庫(kù)組成。Pik3ca點(diǎn)突變（如H047R）引起具有譜系特征的乳腺上皮細(xì)胞分化為多能干細(xì)胞樣狀態(tài)能力損失。而且，Pik3ca乳腺腫瘤的細(xì)胞來源主導(dǎo)了其惡性程度，表明了在改善抗癌癥藥物及治療效果的特異性方面，準(zhǔn)確找到腫瘤細(xì)胞來源具有非常重要的實(shí)際意義。

6. 驗(yàn)證新藥物靶點(diǎn)

考慮到不是所有的癌基因都是維持腫瘤形成所必須的，因此，在針對(duì)相應(yīng)的靶點(diǎn)藥物，開展人體臨床試驗(yàn)前，即在臨床前的動(dòng)物體內(nèi)，驗(yàn)證滅活TSG，或者降低致癌基因是否能引起進(jìn)行中腫瘤的萎縮成為非常重要的試驗(yàn)。應(yīng)用可誘導(dǎo)小鼠模型可實(shí)現(xiàn)對(duì)致癌基因維持腫瘤相關(guān)性的驗(yàn)證，如在乳腺癌小鼠模型中，癌基因Pik3ca表達(dá)去誘導(dǎo)后，引起部分腫瘤的萎縮，提示這些腫瘤是與“依賴”廣泛性活性P13K信號(hào)密切相關(guān)的。然而，多數(shù)腫瘤最終因Met或Myc增加而復(fù)發(fā)，提示這些遺傳損傷可能會(huì)誘導(dǎo)對(duì)P13K抑制劑的耐受性。此例子說明可誘導(dǎo)GEM模型應(yīng)用于臨床前研究，不僅可達(dá)到驗(yàn)證藥物靶點(diǎn)的目的，而且對(duì)揭示藥物耐受性的形成機(jī)制也具有其實(shí)際意義。

TSG也有可能成為有效的藥物靶點(diǎn)。由于p53基因的顯性負(fù)作用或抑制突變，以及其特異性抑制劑MDM2和MDM4的增加/過表達(dá)等的原因，導(dǎo)致腫瘤中的p53功能喪失。應(yīng)用可逆轉(zhuǎn)抑制p53活性的GEM模型遺傳學(xué)研究表明，重新恢復(fù)p53基因功能，可快速使已形成的腫瘤消退，提示研制抑制MDM2分子，從而恢復(fù)p53功能，或?qū)⑼蛔冃蚿53重新恢復(fù)為具有野生型功能p53的抗腫瘤藥物的臨床意義。同樣，應(yīng)用可誘導(dǎo)敲低APC的GEM模型研究結(jié)直腸癌的結(jié)果也表明，誘導(dǎo)恢復(fù)APC功能后，可迅速引起快速與廣泛的腫瘤細(xì)胞分化和持續(xù)的無(wú)復(fù)發(fā)萎縮，這為體內(nèi)評(píng)價(jià)APC/Wnt通路作為APC突變引起的結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)提供了依據(jù)。

7. 闡明治療效應(yīng)與耐受

為了將臨床試驗(yàn)中抗腫瘤新療法失敗的風(fēng)險(xiǎn)盡量降低到最低，建立臨床前高效及預(yù)測(cè)性強(qiáng)的體內(nèi)模型，客觀評(píng)估相應(yīng)藥物效應(yīng)及耐受性就顯得更加重要。通過Kras突變引起的肺癌和胰腺癌的GEM模型的研究發(fā)現(xiàn)，GEM模型對(duì)靶向治療和傳統(tǒng)化療的應(yīng)答效應(yīng)與相應(yīng)病人的應(yīng)答性具有非常大的相似性。需要加以關(guān)注的是小鼠與人在藥物代謝方面表現(xiàn)明顯不同，比如，參與肝臟藥物代謝的細(xì)胞色素P450酶底物特異性方面，不同的物種存在較大的差異。該類問題可借助人源化小鼠模型加以解決。因此，建立人源化的GEM模型作為臨床前藥物效果的研究，將有助于優(yōu)化針對(duì)靶特異抗腫瘤藥物的研發(fā)，以及尋找與確定治療效應(yīng)的關(guān)鍵因素，并使其成為腫瘤病人特征的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)記。另外，GEM模型也可應(yīng)用于探索治療敏感性腫瘤獲得性耐藥的形成機(jī)制。

在探討腫瘤治療效應(yīng)與耐受機(jī)制方面，K14cre; Brca1-f/f; Trp53-f/f (KB1P) 小鼠是作為BRCA1突變?nèi)橄侔┡R床前GEM模型的一個(gè)非常有說服力的例子。KB1P小鼠可形成完全模擬類人BRCA1突變?nèi)橄侔┙M織病理學(xué)特征的乳腺腫瘤，而且，對(duì)含鉑類藥物和PARP抑制劑也具有高敏感性。臨床試驗(yàn)證實(shí)，PARP抑制劑Olaparib可以治療卵巢腫癌，乳腺癌和結(jié)直腸癌。 雖然該藥物并不對(duì)所有這類癌癥病人的治療都有效果，但其對(duì)BRCA1突變攜帶者表現(xiàn)有明顯治療效果，可能與PARP抑制劑合用引起的協(xié)同致死作用與BRCA1缺乏有關(guān)。BRCA1突變細(xì)胞對(duì)PARP抑制劑表現(xiàn)為更加容易被損傷，因?yàn)镻ARP抑制劑誘發(fā)的單一鏈DNA斷裂，可導(dǎo)致DNA復(fù)制時(shí)的雙鏈斷裂，造成BRCA1缺失細(xì)胞無(wú)法實(shí)施同源重組機(jī)制來修復(fù)損傷的DNA。

根據(jù)Olaparib在臨床試驗(yàn)中獲得的理想效果，F(xiàn)DA于2014年12月批準(zhǔn)了該藥用于BRCA1/2突變卵巢癌病人的治療。盡管病人對(duì)該藥物有很好的反應(yīng)效果，然而，在病人和GEM模型研究中都發(fā)現(xiàn)了獲得性藥物耐受性。通過臨床前KB1P小鼠模型研究證實(shí)，這類耐藥機(jī)制與藥物運(yùn)輸物及同源重組恢復(fù)等數(shù)量的增加有關(guān)。這些研究結(jié)果有助于了解臨床上耐藥性的產(chǎn)生, 以及設(shè)計(jì)針對(duì)Olaparib耐藥病人的改進(jìn)治療策略。

關(guān)于腫瘤治療效應(yīng)與藥物耐受性的關(guān)系，現(xiàn)在也是越來越清楚，即其影響不僅受腫瘤細(xì)胞自身因素，而且與成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞等基質(zhì)因素有關(guān)。通過PDAC的GEM模型進(jìn)行腫瘤干預(yù)研究的結(jié)果表明，治療是抑制旁泌性相關(guān)信號(hào)通路，減少促結(jié)締組織增生腫瘤基質(zhì)，增加腫瘤脈管系統(tǒng)，導(dǎo)致促進(jìn)抗腫瘤藥物導(dǎo)入腫瘤部位的過程。然而，關(guān)于攻擊PDAC中的腫瘤基質(zhì)的概念，最近有兩個(gè)研究對(duì)該理論進(jìn)行了挑戰(zhàn)。這兩研究結(jié)果表明，基質(zhì)因素可能通過阻止腫瘤血管形成，引起不是促進(jìn)而是抑制PDAC生長(zhǎng)。所以，這些研究都揭示了腫瘤微環(huán)境在治療耐受性方面，發(fā)揮了比過去想象的更加重要的，且復(fù)雜的作用。

8. 腫瘤免疫治療

在過去十年，通過對(duì)免疫反應(yīng)的深刻揭示與認(rèn)識(shí)，建立了利用病人免疫系統(tǒng)攻擊腫瘤的治療策略。近年來的黑色素瘤和肺癌臨床病人試驗(yàn)已證實(shí)，包括抗CTLA-4和抗PD-1的免疫檢查點(diǎn)抑制物，在增強(qiáng)病人有效抗腫瘤免疫及改善生存率等方面具有巨大潛力。這些臨床試驗(yàn)基礎(chǔ)是來自過去幾十年在實(shí)驗(yàn)小鼠模型上開展的基礎(chǔ)研究，從而揭示了CTLA-4和PD-1在阻止免疫反應(yīng)中的重要性，特別是通過對(duì)CTLA-4和PD-1敲除小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重與溫和程度的自發(fā)性自身免疫表型的明確證實(shí)，應(yīng)用CTLA-4抑制物引起接種腫瘤小鼠的抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)增加，產(chǎn)生腫瘤排斥作用，提示釋放T細(xì)胞上的剎車可能是抵抗腫瘤的一個(gè)潛力的應(yīng)對(duì)策略。盡管如此，同時(shí)也應(yīng)該清楚的了解，仍有一定比例的病人對(duì)此類免疫治療沒有反應(yīng)，且目前的挑戰(zhàn)是還不知道其真正原因。

目前，雖然絕大部分的免疫學(xué)研究都是在腫瘤移植小鼠模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，但就現(xiàn)在研究情況預(yù)測(cè)表明，今后GEM模型應(yīng)用于該領(lǐng)域的研究將會(huì)越來越多。應(yīng)用GEM模型研究的部分結(jié)果表明，在新形成的腫瘤過程中，因腫瘤引起的耐受機(jī)制，T細(xì)胞喪失其對(duì)腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)性，特別明顯的是，如果將來自GEM模型小鼠形成的腫瘤細(xì)胞，接種至免疫缺陷小鼠體內(nèi)，腫瘤會(huì)快速生長(zhǎng)，而野生小鼠則能排斥這些腫瘤細(xì)胞。提示這些腫瘤細(xì)胞沒有失去其免疫原性，T細(xì)胞仍然能識(shí)別這些細(xì)胞并發(fā)揮其攻擊作用。但在原發(fā)腫瘤小鼠的體內(nèi)這些T細(xì)胞卻無(wú)能為力。

腫瘤常常被認(rèn)為是慢性炎癥的結(jié)果，這種炎癥可引起局部和系統(tǒng)免疫抑制，從而不利于T細(xì)胞發(fā)揮其有效的功能。而且，腫瘤常表現(xiàn)為樹狀突細(xì)胞（DC)功能缺失，導(dǎo)致T細(xì)胞啟動(dòng)缺損。例如，在MMTV-PyMT乳腺腫瘤小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，原本具有潛在激活抗腫瘤T細(xì)胞的DC細(xì)胞，會(huì)被大量存在的巨噬細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)抑制，這些巨噬細(xì)胞起到了阻止特定T細(xì)胞激活的作用。最近的研究也證實(shí)，促進(jìn)DC細(xì)胞功能或阻止骨髓細(xì)胞引起的免疫抑制，可以達(dá)到改善免疫檢查點(diǎn)抑制物的抗腫瘤效果。因此，對(duì)腫瘤病人實(shí)施耐受T細(xì)胞免疫激活療法的時(shí)候，結(jié)合應(yīng)用針對(duì)改善免疫抑制或則增強(qiáng)T細(xì)胞啟動(dòng)的靶點(diǎn)藥物，在臨床上可能會(huì)起到更好的治療效果。

相對(duì)于腫瘤接種模型，應(yīng)用GEM模型進(jìn)行免疫治療研究需要不同的方法�？紤]到GEM模型中腫瘤是在每個(gè)獨(dú)立小鼠體內(nèi)發(fā)生的，如同病人腫瘤的發(fā)生過程，具有特殊的腫瘤抗原。因而，具有其異質(zhì)性的特點(diǎn)，從而確保區(qū)別鑒定反應(yīng)和非反應(yīng)腫瘤之間的分子不同，也有助于臨床預(yù)測(cè)的生物標(biāo)記物的建立。然而，對(duì)于大多數(shù)GEM模型來源的腫瘤來說，辨認(rèn)可被T細(xì)胞識(shí)別的表達(dá)腫瘤抗原卻是未知的。為了克服這點(diǎn)，可借助基因修飾的方式，將臨床上相關(guān)腫瘤抗原引入小鼠體內(nèi)，使其具有誘發(fā)腫瘤特異性T細(xì)胞反應(yīng)的效果。比如，應(yīng)用低免疫原性的腫瘤（如肉瘤和肺癌），將腫瘤特異性抗原引入至GEM模型后，這些腫瘤的免疫原性增加，引起潛在而短時(shí)間的抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)。起初的抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)很快發(fā)生，然后是可調(diào)控T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制。因此，這些模型將有助于目前與未來相關(guān)研究，以達(dá)到揭示免疫逃逸的復(fù)雜機(jī)制，最終研發(fā)具有改善的腫瘤免疫治療的新策略的目的。

9. 與臨床試驗(yàn)并行的GEM模型

最近推出的“與臨床共試驗(yàn)” 范例，目的是將臨床前GEM實(shí)驗(yàn)與人體臨床試驗(yàn)同時(shí)開展，從而達(dá)到預(yù)測(cè)治療效果的作用。該策略已經(jīng)應(yīng)用于前列腺癌治療中，并成功揭示了由雄性激素誘發(fā)的耐受性與某些遺傳關(guān)鍵因子有關(guān)，以及克服去勢(shì)難治性的新綜合療法。同樣，應(yīng)用NSCLC的GEM模型的一起臨床試驗(yàn)表明，Kras/Lkb1突變肺癌較Kras or Kras/p53突變腫瘤對(duì)臨床上的Docetaxel和MEK抑制劑Selumetinib的聯(lián)合療法，表現(xiàn)為更加具有耐受性。揭示了LKB1是臨床試驗(yàn)中對(duì)此類藥物聯(lián)合療法耐受的潛在決定因素。這類研究表明，應(yīng)用GEM模型作為人腫瘤臨床前藥物效果研究，能發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物和聯(lián)合療法。

GEM在腫瘤學(xué)研究中發(fā)展趨勢(shì)與未來展望

許多抗腫瘤藥物在臨床試驗(yàn)中未能達(dá)到臨床前實(shí)驗(yàn)的期望目的，已經(jīng)成為目前腫瘤學(xué)與轉(zhuǎn)化癌癥醫(yī)學(xué)所面臨的巨大挑戰(zhàn)，如何改善腫瘤學(xué)領(lǐng)域的臨床前研究結(jié)果的預(yù)測(cè)性，也是人們十分關(guān)注的熱點(diǎn)。因此，如何選擇更能真實(shí)反映人腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展過程的臨床前腫瘤動(dòng)物模型，將顯得更加重要了。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，首先需要考慮的是如何建立能真實(shí)反映腫瘤本身及外在特征的臨床前小鼠模型。比如，臨床前模型應(yīng)該含有病人特異性突變，該種突變具有誘發(fā)惡性腫瘤的趨勢(shì)，且在一定病人群中顯示遺傳變化特征。另外，原發(fā)的腫瘤過程是在自然微環(huán)境中進(jìn)行的，如同在人腫瘤進(jìn)行過程中所見的腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間相互作用（包括免疫細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，以及淋巴細(xì)胞和血管的潛入）。再有，由于絕大多數(shù)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的病人已經(jīng)是處于廣泛腫瘤轉(zhuǎn)移疾病過程中，因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)就應(yīng)該考慮選擇能模擬病人疾病不同進(jìn)程狀態(tài)的小鼠模型，開展相應(yīng)的臨床前的藥物效果評(píng)估研究。在現(xiàn)實(shí)的臨床試驗(yàn)中，往往進(jìn)入臨床試驗(yàn)的病人之前多是經(jīng)過不同程度的治療，因而極有可能會(huì)干擾治療效果的驗(yàn)證。而臨床前的動(dòng)物研究則是建立在從來沒有接受任何治療的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，從而導(dǎo)致高估治療效果的結(jié)果。從另外一方面講，臨床試驗(yàn)中對(duì)那些接受過治療的嚴(yán)重病人沒有效果，卻仍有可能對(duì)沒有接受過治療的嚴(yán)重病人有益處。

最近基因修飾模式動(dòng)物技術(shù)的進(jìn)展，促進(jìn)了快速研制更加精準(zhǔn)的能引起原發(fā)腫瘤的小鼠模型，該類模型結(jié)合了特異性腫瘤病人形成發(fā)生發(fā)展過程中腫瘤細(xì)胞本身和細(xì)胞外的特征。預(yù)測(cè)這些新一代的GEM模型和基于GEM模型的移植模型，將是真實(shí)模擬病人腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，研究自發(fā)性轉(zhuǎn)移疾病的最佳模式動(dòng)物。這些模型可作為研究腫瘤形成的復(fù)雜過程（包括腫瘤的起始，器官特異性轉(zhuǎn)移的形成，腫瘤微環(huán)境的參與等方面）的重要而有用工具。但是，對(duì)于腫瘤病人而言，更加重要的是，這些模型能更為深入地揭示免疫治療中的反應(yīng)性與耐受性，以及疾病的復(fù)發(fā)等相關(guān)機(jī)制。期待未來，應(yīng)用新一代GEM模型對(duì)抗腫瘤新藥物臨床前的評(píng)估研究，將會(huì)增加預(yù)測(cè)其在臨床試驗(yàn)中的成功率，從而加速抗腫瘤新藥策略設(shè)計(jì)與臨床實(shí)施，達(dá)到改善防治腫瘤病人的病情的最終目的。

作者簡(jiǎn)介

俞曉峰博士，國(guó)際知名模式動(dòng)物和細(xì)胞生物學(xué)專家，先后就任于耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院、iTL基因打靶公司和紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院以及美國(guó)ASC生物技術(shù)公司等機(jī)構(gòu)，在遺傳修飾模式動(dòng)物領(lǐng)域有超過20年的研發(fā)和管理經(jīng)驗(yàn)。目前任職于賽業(yè)生物科技，任高級(jí)副總裁和高級(jí)科學(xué)家，主要負(fù)責(zé)基因修飾模式動(dòng)物平臺(tái)的技術(shù)工作，其研究成果多次發(fā)表在Nat Immunol、Mol Cell Biol等高水平雜志上。

 

主要參考文獻(xiàn)：

1.  Li K,  Wang F，Cao WB,  and ZW et al (2017)  TRIB3 Promotes APL Progression

through Stabilization of the Oncoprotein PML-RARa and Inhibition of p53-Mediated Senescence. Cancer Cell 31, 697–710

2.  Tang X，Shi L，and Liu B et al (2017) SIRT7 antagonizes TGF-β signaling and inhibits breast cancer metastasis. Nature Communications 8: 318

3.    Liu C, Ren YF,  Yi Lv and Xu-Feng Zhan et al (2017) Activation of SRY Accounts for Male-Specific Hepatocarcinogenesis: Implication in Gender Disparity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Letters 410: 20-31

4.    Chunga WJ,  Daemena A, Melissa R, and Junttila MR et al (2017) Kras mutant genetically engineered mouse models of human cancers are genomically heterogeneous. PNAS Dec 4, E10947–E10955

5.    Annunziato S, Kas SM, Nethe M, and Drenth AP et al (2016) Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes Dev 30: 1470 – 1480

6.    Drost R, Dhillon KK, and Schut E et al (2016) BRCA1185delAG tumors may acquire therapy resistance through expression of RING-less BRCA1. J Clin Invest 126: 2903 – 2918

7.    Maresch R, Mueller S, and Barenboim M et al (2016) Multiplexed pancreatic genome engineering and cancer induction by transfection-based CRISPR/ Cas9 delivery in mice. Nat Commun 7: 10770

8.    Chiou SH, Winters IP, Wang J,  and Chuang CH et al (2015) Pancreatic cancer model-ing using retrograde viral vector delivery and in vivo CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing. Genes Dev 29: 1576 – 1585

9.    Weber J, Öllinger R, and Engleitner T et al (2015) CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci USA 112: 13982 – 13987

10.   Dow LE, O’Rourke KP,  and Lowe SW et al (2015b) Apc restoration promotes cellu-lar differentiation and reestablishes Crypt homeostasis in colorectal cancer. Cell 161:1539 – 1552

11.   Henneman L, van Miltenburg MH, and Schlicker A et al (2015) Selective resistance to the PARP inhibitor olaparib in a mouse model for BRCA1-deficient metaplastic breast cancer. Proc Natl Acad Sci USA 112: 8409 – 8414

12.   Clohessy JG, Pandolfi PP (2015) Mouse hospital and co-clinical trial project- from bench to bedside. Nat Rev Clin Oncol 12: 491 – 498

13.   Cong L, Ran FA, Cox D,  and Marraffini LA et al (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339: 819 – 823

14.   Jamieson T, Clarke M, and Nibbs RJB et al (2012) Inhibition of CXCR2 profoundly suppresses inflammation-driven and spontaneous tumorigenesis. J Clin Invest 122: 3127 – 3144

15.   Drake AC, Chen Q, Chen J (2012) Engineering humanized mice for improved hematopoietic reconstitution. Cell Mol Immunol 9: 215 – 224

16.   Liu P, Cheng H, and Fox EA et al (2011) Oncogenic PIK3CA-driven mammary tu-mors frequently recur via PI3K pathway-dependent and PI3K pathway- independent mechanisms. Nat Med 17: 1116 – 1120

17.   Martins CP, Brown-Swigart L, and Evan GI (2006) Modeling the therapeutic efficacy of p53 restoration in tumors. Cell 127: 1323 – 1334

18.   Shibata H, Toyama K, Shioya H, and Toyoshima K et al (1997) Rapid colorectal adenoma formation initiated by conditional targeting of the Apc gene. Science 278: 120 – 123