細胞尿激酶（UROKINASE）活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書
細胞尿激酶（UROKINASE）活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版） 主要用途
細胞尿激酶（ UROKINASE ） 活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過三肽化合物底物p-ERG-pNA 受到尿激酶的水解，釋放黃色對硝基苯胺，產(chǎn)生吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細胞裂解萃取樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體等）尿激酶的活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷， 性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
尿激酶（urokinase；UK；EC3.4.21.73），又稱為尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（urokinase-type PlasminogenActivator；uPA），屬于絲氨酸蛋白酶，存在于血液、細胞外基質(zhì)和尿液中。尿激酶由411氨基酸構(gòu)成，分子量為54KD，有3個結(jié)構(gòu)域：絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域、kringle結(jié)構(gòu)域和生長因子結(jié)構(gòu)域。其主要的生理性底物為纖維蛋白溶酶原（Plasminogen），即纖維蛋白溶酶（plasmin）的酶原形式（zymogen），切離部位為 Cys-Pro-Gly-Arg⊥Val -Val-Gly-Gly-Cys。一旦切離后激活，纖維蛋白溶酶參與細胞蛋白水解過程，包括血栓溶解（thrombolysis）和細胞外基質(zhì)降解等。尿激酶與組織重構(gòu)、修復(fù)、血管形成（angiogenesis）性疾病和腫瘤擴散有關(guān)。尿激酶的抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpins），即纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑（Plasminogen Activator Inhibitor；PAI）�；谌斯ず铣傻娜幕衔锏孜飌-EGR-pNA（pyro-Glu-Gly-Arg-p-Nithoaniline；焦谷氨酸酰甘氨酰精氨酰對硝基苯胺）受到尿激酶的水解，釋放有色對硝基苯胺，在分光光度儀（405nm 波長）下，測定吸光峰值的變化，來定量測定尿激酶的活性。尿激酶反應(yīng)系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
緩沖液（Reagent C） 毫升
陰性液（Reagent D） 毫升
底物液（Reagent E） 微升
產(chǎn)品說明書 1 份
存方式
保存 清理液（Reagent A）在 4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里； 底物液（Reagent E）避免光照和反復(fù)凍融；有效保證 6 月
用戶自備
15 毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
1.5 毫升離心管：用于樣品制備和儲存的容器
細胞刮脫棒：用于細胞脫離
微型臺式離心機：用于樣品沉淀培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育
酶標板或比色皿：用于樣品比色測定的容器酶標儀或分光光度儀：用于樣品比色分析
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 底物液（Reagent E）置入冰槽里融化，避免光照。然后進行下列操作。
一、 樣品制備
1. 準備好 25cm2細胞培養(yǎng)瓶或 60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1 至 5 X 106細胞）
2. 小心加入xx 毫升 清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
5. 加入xx 毫升 清理液（Reagent A），混勻細胞
6. 移入到預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
7. 放進 4℃臺式離心機離心 5 分鐘，速度為 300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx 微升 裂解液（Reagent B），充分混勻
10. 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 1.5 毫升離心管
11. 強力渦旋震蕩 15 秒
12. 置于冰槽里孵育 30 分鐘
13. 放進 4℃微型臺式離心機離心 5 分鐘，速度為 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）
14. 小心移取 500 微升上清液到新的預(yù)冷的 1.5 毫升離心管
15. 移取 10 微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－
YIJI30030.1）
16. 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作二、 測定準備
1. 準備好上述制備的待測樣品
2. 設(shè)定好酶標儀（溫度為 37℃）：波長 405nm，并置零三、 活性測定
1. 在 96 孔酶標板上做好相應(yīng)標記：背景對照和樣品
2. 分別移取xx 微升 緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔中
3. 分別加入xx 微升 陰性液（Reagent D）或上述制備的待測樣品（50 微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
4. 分別加入xx 微升 底物液（Reagent E）
5. 輕輕搖動 96 孔酶標板（注意：避免氣泡）
6. 在 37℃溫度下孵育 60 分鐘（注意：可見反應(yīng)孔里呈現(xiàn)肉眼可見的黃色）
7. 即刻放進酶標儀檢測或轉(zhuǎn)移到 100 微升比色皿，在分光光度儀里檢測
8. 活性計算：
（1） 酶標儀檢測
單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘
（2） 比色皿檢測
單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘
注意事項
1. 本產(chǎn)品為 21 次操作，包括背景對照
2. 操作時，須戴手套
3. 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需 1 次
4. 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融
5. 測定值由低到高變化；測定可持續(xù) 60 分鐘
6. 比色測定后，比色皿須清洗徹底
7. 樣本測定 60 分鐘讀數(shù)高于 0 分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
8. 建議待測樣本蛋白濃度為 50 微克/5 微升；如果樣本酶活性過低，則可以延長反應(yīng)孵育時間至 16 小時； 其次增加樣本量（本公司提供 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒YIJI30030.1）
9. 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
10. 尿激酶單位活性定義為：在 37℃，pH 7..5 條件下，每分鐘內(nèi)能夠切離 1 微摩爾三肽化合物底物
p-ERG-pNA 所需的酶量作為一個活性單位
11. 本公司提供系列細胞蛋白酶學(xué)檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標準
1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感
