非損傷微測技術(shù)應(yīng)用于沙柳致病蛋白抑制植物耐鹽能力研究

致病相關(guān)（PR）蛋白參與植物防御，其具有多種功能適應(yīng)性，有助于抵抗各種病原體、提高環(huán)境脅迫耐受性。沙柳是一種生長迅速的柳樹品種，可以耐受許多不利環(huán)境。

中國林科院亞熱帶林業(yè)研究所卓仁英研究員課題組在Environmental and Experimental Botany上發(fā)表了一篇文章，題目為“Pathogenesis-related protein PR10 from Salix matsudana Koidz exhibits resistance to salt stress in transgenic Arabidopsis thaliana”，主要探究PR蛋白在植物耐鹽機制中起到的作用。

前期的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明：沙柳PR蛋白（SmPR10）較為豐富，經(jīng)過100 mM NaCl處理后表達(dá)上調(diào)。本實驗以沙柳為材料，克隆并鑒定了SmPR10基因，以驗證其在耐鹽性中的作用。SmPR10的氨基酸序列與紫蘇柳和毛白楊的PR蛋白的序列同源性分別為98%和93%。SmPR10定位在擬南芥原生質(zhì)體的胞質(zhì)中，根的轉(zhuǎn)錄及蛋白水平較高，且100mM NaCl處理后表達(dá)上調(diào)。免疫定位分析發(fā)現(xiàn)，韌皮部纖維細(xì)胞和根木質(zhì)部中特異性的檢測到SmPR10。而且，SmPR10的異質(zhì)過表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性，具體表現(xiàn)在根長度、根數(shù)量、Na⁺流速、以及葉綠素含量、MDA含量、電導(dǎo)率等生理參數(shù)及SOD和POD酶活性水平。

擬南芥根部Na⁺流檢測圖

對照組、鹽脅迫組擬南芥根部Na⁺流結(jié)果。正值表示外排

其中，Na⁺流速利用基于非損傷微測技術(shù)（Non-invasive Micro-test Technology, NMT）的NMT活體生理檢測儀 Physiolyzer^®進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)正常條件下，轉(zhuǎn)基因組與野生對照組的Na⁺外排相似。但是，100mM NaCl處理后，轉(zhuǎn)基因組的Na⁺外排明顯增加。這說明：相比于野生型，SmPR10過表達(dá)幼苗根部的Na⁺外排能力更高，從而更加耐鹽。

1、工業(yè)原料昆蟲相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)的基礎(chǔ)研究

紫膠、白蠟、五倍子研究是資源昆蟲所的優(yōu)勢。在提升五倍子質(zhì)量、產(chǎn)量研究過程中，五倍子同母體間營養(yǎng)物質(zhì)、信號的交換運輸，可以通過非損傷對母體-蟲癭連接部進(jìn)行檢測。類似的研究，在愈傷組織上已經(jīng)開展。

此外，蠶絲形成的主要器官絲腺，也有研究者已經(jīng)利用非損傷開展離子轉(zhuǎn)運相關(guān)研究。

2、森林病蟲害研究

1）蟲害

“離子流信號是植物感受外界刺激的原初信號”。北京林業(yè)大學(xué)沈應(yīng)柏教授在接受中關(guān)村非損傷微測技術(shù)產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟（簡稱“NMT聯(lián)盟”）采訪時表示，在植物抗蟲防御研究中，植物為什么能夠識別出昆蟲取食？這與離子流信號的傳遞密切相關(guān)。

在應(yīng)對外界刺激時，植物也會做出多種調(diào)整，其中很重要的一點就是調(diào)節(jié)氣孔的開閉。沈應(yīng)柏教授利用非損傷，對氣孔調(diào)節(jié)機制進(jìn)行了深入研究，并在Plant Journal（2015, 83(4): 638-649.）上發(fā)表了研究成果。

2）病害

Ca²⁺振蕩是病原菌與植物形成穩(wěn)定互作的標(biāo)志。

病原菌侵染后葉肉組織的Ca²⁺流振蕩現(xiàn)象

J Membrane Biol, 1998, 161(1): 45-54.

90年代末，研究者們就開始利用NMT研究植物病原體侵染過程的微觀信號傳遞。目前的研究成果顯示，病原體侵染植物的過程，與Ca²⁺、K⁺、Cl^-等諸多離子流信號相關(guān)。

• Plos Pathog：農(nóng)科院寧約瑟中農(nóng)王毅|NMT驗證稻瘟病菌利用K通道抑制先天免疫

• 植物病原防御第一步：Ca²⁺相關(guān)質(zhì)膜陰離子通道打開

• Ca²⁺外流作為細(xì)胞防御過程中的標(biāo)志性反應(yīng)

3、森林培育之良種生產(chǎn)

耐鹽堿、耐瘠薄、生長周期短、產(chǎn)量高。非損傷在林木育種領(lǐng)域的應(yīng)用，相比于其它領(lǐng)域尤為突出。北京林業(yè)大學(xué)陳少良教授是國內(nèi)最先應(yīng)用NMT進(jìn)行林木抗逆研究的研究者，其2009年發(fā)表的通篇使用NMT離子流數(shù)據(jù)的文章（Plant Physiol, 2009, 149: 1141-1153.），引用次數(shù)已達(dá)177次。目前，Na⁺、K⁺、H⁺流，已成為陳少良教授實驗室研究的基石。

其后，來自林科院蘇曉華研究員、西北農(nóng)林科技大學(xué)（現(xiàn)中國林科院）的羅志斌教授、東北林業(yè)大學(xué)（現(xiàn)浙江農(nóng)林大學(xué)）柳參奎教授、林科院亞林所卓仁英研究院，在林木鹽堿脅迫、氮營養(yǎng)、重金屬脅迫等領(lǐng)域，發(fā)表了諸多研究成果。

• Front Plant Sci：林科院亞林所卓仁英NMT驗證Cu/Zn SOD促進(jìn)植物富集鎘

• J Exp Bot：西北農(nóng)林羅志斌組楊樹適應(yīng)氮受限環(huán)境的代謝機制

• Plant Biotechnol J：PutVHA-c促根系排Na提升植物耐鹽能力