sapphire檢測(cè)殘留的宿主細(xì)胞蛋白HCP的方法

許多生物制品例如抗體，重組蛋白，疫苗等的制備還是通過生物體系細(xì)胞工程合成，盡管采用多種純化方式，在生物藥物中還會(huì)有微量的宿主蛋白殘留（HCP），會(huì)對(duì)藥品的安全性及藥性產(chǎn)生影響。

一、HCP的概念

HCP：Host cell protein，宿主細(xì)胞蛋白

疫苗、抗體、重組蛋白藥物等生物制品的生產(chǎn)主要利用某些細(xì)胞諸如非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）和中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞，大腸桿菌等材料，這些細(xì)胞稱為宿主細(xì)胞。

在純化工藝中會(huì)有宿主細(xì)胞分泌至培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)或死亡破碎細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白殘留在生物制品中，這些蛋白被稱為宿主細(xì)胞蛋白。例如vero細(xì)胞HCP是指疫苗中來源于宿主細(xì)胞蛋白和轉(zhuǎn)化蛋白，以vero細(xì)胞為基質(zhì)細(xì)胞生產(chǎn)疫苗的過程是將病毒接種于vero細(xì)胞，病毒利用細(xì)胞環(huán)境復(fù)制自身，同時(shí)導(dǎo)致宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損、死亡，釋放大量

的宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白于疫苗中，這部分蛋白有可能成為疫苗中的過敏原vero細(xì)胞生長的同時(shí)向培養(yǎng)液中釋放生長因子等促生長蛋白，可引起細(xì)胞的增值和分化，vero細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白和促生長蛋白構(gòu)成了宿主細(xì)胞蛋白。

• 為什么要檢測(cè)殘留HCP

· 生物制品中殘留的宿主細(xì)胞蛋白（HCP）作為外源蛋白可能在不同程度上引發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致過敏反應(yīng)或其他不良反應(yīng)--例如發(fā)熱、水腫，甚至休克等同時(shí)人體的免疫應(yīng)答性質(zhì)和效果，會(huì)受到HCP濃度，數(shù)量和個(gè)體免疫系統(tǒng)差異而不同，藥物監(jiān)管部門最關(guān)注用藥者的安全性，所以HCP的監(jiān)控檢測(cè)變得越來越重要。

· 《中華人民共和國藥典》明確規(guī)定，CHO細(xì)胞殘余蛋白占總蛋白含量要小于0.05%以下才符合規(guī)定。

· 美國FDA規(guī)定，用一種靈敏度較高的方法檢測(cè)藥品中的HCP，其含量應(yīng)該低于檢測(cè)限（通常小于100ppm）

三、殘留HCP的檢測(cè)方法

·SDS-PAGE

·2D電泳

·蛋白質(zhì)印記（western blot）

·酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）

·高效液相層析（HPLC）

四、基于Sapphire的殘留HCP檢測(cè)

首先采用2D 雙向電泳技術(shù)高校分離HCP，一塊膠跑宿主細(xì)胞全蛋白2D電泳，之后染色使用sapphire儀器進(jìn)行掃描成像，另一塊膠跑生物制品的2D電泳，然后將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，經(jīng)過封閉，一抗，熒光二抗雜交，使用sapphire進(jìn)行western blot熒光信號(hào)采集，通過結(jié)合2D 電泳和wesern blot結(jié)果比對(duì)鑒定，相比傳統(tǒng)的單獨(dú)的ELISA和WB方法，2D 電泳和WB技術(shù)能夠更為全面精準(zhǔn)的鑒定微量的HCP

五、應(yīng)用領(lǐng)域

檢測(cè)疫苗等蛋白藥物中殘余的HCP類別和殘留水平

檢測(cè)重組蛋白中殘余的HCP類別和殘留水平

鑒定抗體產(chǎn)物中殘余的HCP類別和殘留水平