定量western：最佳的蛋白印跡標準化方法是什么？

瀏覽次數(shù)：5166　發(fā)布日期：2018-10-9　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

現(xiàn)代數(shù)字檢測儀器對于western blotting不僅僅是檢測“有或沒有”的技術(shù)，還可以進行western blotting重復(fù)性和定量的檢測。在檢測方法的線性動態(tài)范圍，對數(shù)據(jù)進行標準化以控制蛋白上樣量和膜轉(zhuǎn)印帶來的變化，可以獲得真正的定量結(jié)果。但是，對蛋白印跡進行標準化的最佳方法是什么？過去，金標準標準化方法是使用看家蛋白，基于這些蛋白在不同實驗條件下和細胞系中表達一致的假設(shè)。然而，最近的研究表明，這種假設(shè)并不總是正確的，導(dǎo)致相對蛋白豐度的測量結(jié)果不準確。相反，定量Western blotting專家和他們發(fā)表的期刊正在推薦一種新的金標準用于標準化 - 通過在膜上染色，檢測每個泳道的總蛋白進行標準化分析。

Western blot標準化：看家蛋白和總蛋白

使用看家蛋白進行標準化

使用看家蛋白最大缺點是在樣品間和不同條件下表達水平可能不一致。如使用看家蛋白進行標準化，必須先花費時間和精力來驗證蛋白的選擇，并且可能需要檢查多種潛在的標準品，然后才能找到一種在所有樣品中真正表達同一水平，并且在不同實驗條件下不會發(fā)生變化的標準品。

使用看家蛋白的第二個重大挑戰(zhàn)是它們的表達豐度很高，如果樣品中的看家蛋白表達非常高，這會限制在凝膠上加載的樣品量，因為需要保留看家蛋白在線性檢測范圍內(nèi)并且不會使看家蛋白的信號飽和。如果感興趣的蛋白不是同樣高度表達，這兩種蛋白質(zhì)不在同一線性檢測范圍內(nèi)。

如果您正在進行多重蛋白印跡，例如比較同一蛋白質(zhì)的磷酸化和非磷酸化形式，則需要考慮的第三個挑戰(zhàn)是從不同物種中產(chǎn)生一抗和二抗的復(fù)雜性。

最后，檢測的看家蛋白可能干擾感興趣蛋白的檢測。理想情況下，看家蛋白應(yīng)該與感興趣蛋白的大小不同，因此這兩種蛋白可在印跡上空間分辨。當實驗在同一印跡上檢查多種目的蛋白時，這變得越來越困難。

圖1.與常見的看家蛋白相比，AzureRed具有更寬的線性動態(tài)范圍

單色通道圖像A）AureRed染色總蛋白B）Tubulin C）β-action和D）GAPDH。 AzureRed信號的優(yōu)異動態(tài)范圍與實際加載的蛋白量顯示在圖像（A）中。使用AzureSpot軟件定量來自總蛋白和看家蛋白的信號，并將得到的值相對于每個樣品加載的蛋白量（E）作圖。與常見的看家蛋白相比，AzureRed表現(xiàn)出更強的相關(guān)性和更廣泛的動態(tài)范圍。

圖2.使用AzureRed熒光蛋白染色法將tubulin條帶信號進行總蛋白標準化

使用AzureSpot軟件定量tubulin蛋白條帶。原始的tubulin條帶灰度（藍色直方圖）和總蛋白標準化的條帶灰度（橙色直方圖）。使用AzureRed標準化信號可校正上樣誤差或膜轉(zhuǎn)印所產(chǎn)生的差異。

使用總蛋白進行標準化

使用總蛋白標準化，不是試圖找到可以代表轉(zhuǎn)移到膜上的樣品總量的蛋白，而是直接在膜上測量總蛋白，并且該值在標準化時用作分母。許多總蛋白染色劑可用于染色凝膠和膜�？偟鞍兹旧峁└鼘挼膭討B(tài)范圍，并且表現(xiàn)出比看家蛋白更低的可變性和更清楚的數(shù)據(jù)。

總蛋白標準化比使用看家蛋白質(zhì)快得多，特別是對于化學(xué)發(fā)光印跡，因為相對于剝離和重孵育染色步驟花費較少的時間。理想情況下，在免疫檢測之前或之后，在膜上進行總蛋白染色。使用一些染色劑如AzureRed Fluorescent Total Protein Stain，可以在免疫檢測前對印跡進行染色，然后與目的蛋白同時對總蛋白進行成像(S)。通過這種最簡單的工作流程，目的蛋白和總蛋白的圖像會自動對齊。

與使用看家蛋白相比，圖像捕獲后的分析工作流程基本不變; 整個泳道或泳道中大部分信號用于標準化，而不是單一的條帶。

用總蛋白染色劑對膜進行染色提供了額外的質(zhì)控優(yōu)勢，可以驗證轉(zhuǎn)印是否完全。