細菌胞漿內鈣離子濃度熒光（Fura-2）檢測試劑盒產品說明書

細菌胞漿內鈣離子濃度熒光（Fura-2）檢測試劑盒產品說明書（中文版）
 主要用途 
細菌胞漿內鈣離子濃度熒光（Fura-2）檢測試劑是一種旨在通過胞漿鈣離子特異性熒光探針Fura-2-AM，與鈣離子結合后，其熒光強度顯著增強，在熒光酶標儀下測量不同激發(fā)波長下相對熒光峰值的比值，來測定細菌胞漿總鈣離子濃度的權威而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種活體細菌胞漿鈣離子的濃度檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。
 技術背景
 細胞漿鈣離子在調節(jié)鈣離子通道，維持細胞內環(huán)境鈣離子平衡方面起著重要作用。在細菌中，鈣對于細菌的生長和結構具有重要作用。細胞漿鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求，以及需要細胞漿分離。Fura-2 AM（acetoxy-methyl ester），一種具有細胞膜通透性，與鈣離子結合產生熒光的染料，通過其不同激發(fā)波長340nm/380nm產生的熒光信號比（散發(fā)波長505nm）來精確測定細菌胞漿內鈣離子水平。 
 產品內容
 清理液（Reagent A）      40毫升
染色液（Reagent B） 30微升
介導液（Reagent C）     600微升
飽和液（Reagent D）       2毫升
陰性液（Reagent E）       2毫升
產品說明書     1份
 保存方式
 保存染色液（Reagent B）和介導液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月
 用戶自備
 1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
培養(yǎng)箱：用于染色孵育
100微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板：用于熒光分析的容器
熒光酶標儀：用于熒光分析
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光染色觀察
 實驗步驟
 樣品準備 

• 準備好1毫升待測的細菌樣品（1 X 108細菌/毫升0
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3500g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升清理液（Reagent A），混勻細菌顆粒群
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3500g
• 小心抽去上清液
• 重復實驗步驟4至6一次
• 加入1毫升清理液（Reagent A），混勻細菌顆粒群
• 放進冰槽里備用

 測定準備 

• 設定好熒光酶標儀：激發(fā)波長340nm和380nm，散發(fā)波長505nm
• 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）室溫下融化，然后分別移出30微升介導液（Reagent C）和1.5微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，標記為染色工作液，并放在暗室里備用。然后進行下列操作。 

 二、熒光酶標儀檢測
 準備3個1.5毫升離心管，標記為：細菌樣品管、空白對照管（不含細菌）、最大對照管（含細菌）

• 分別移取100微升上述準備的細菌樣品到細菌樣品管和最大樣品管里
  • 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3500g
• 小心抽去上清液
• 加入100微升清理液（Reagent A）到細菌樣品管里，混勻細菌顆粒群
• 加入100微升飽和液（Reagent D）到最大對照管里，混勻細菌顆粒群
• 加入100微升陰性液（Reagent E）到空白對照管里
• 分別加入10微升染色工作液到所有管里，混勻
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育120分鐘，避免光照
• 轉移到100微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板里
• 即刻放進熒光酶標儀測讀：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU）包括樣品RFU340nm、樣品RFU380nm、空白對照孔RFU340nm、空白對照孔RFU380nm、最大對照孔RFU340nm、最大對照孔RFU380nm
• 計算樣品細菌胞漿鈣離子濃度

 
{【（樣品RFU340nm/樣品RFU380nm）－（空白對照孔RFU340nm/空白對照孔RFU380nm）】÷【（最大對照孔RFU340nm/最大對照孔RFU380nm－樣品RFU340nm/樣品RFU380nm）】}X（空白對照孔RFU380nm/最大對照孔RFU380nm） X 315（納摩爾；解離常數(shù)）
  三、（共聚焦）或熒光顯微鏡檢測
 移取300微升上述準備的細菌樣品到1.5毫升離心管

• 加入30微升染色工作液，混勻
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育120分鐘，避免光照
  • 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3500g
• 小心抽去上清液
• 小心加入500微升清理液（Reagent A），混勻細菌顆粒群
  • 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3500g
• 小心抽去上清液
• 小心加入300微升清理液（Reagent A），混勻細菌顆粒群
• 移取50微升到載玻片上
• 蓋上蓋玻片
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察：激發(fā)波長340至400nm，散發(fā)波長505nm（細菌胞漿鈣離子呈現(xiàn)藍色熒光）

注意事項
 本產品為20次（顯微鏡）或60次（96孔板）操作

• 操作時，須戴手套
• 可以使用熒光分光光度儀檢測
• 避免使用EDTA等處理樣品
• 孵育反應完成后即刻進行熒光測定
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 檢測敏感度可達納摩爾級鈣濃度范圍
• 本公司提供系列鈣生化檢測試劑產品