液相色譜儀的的使用注意事項(xiàng)與故障解決方法

液相色譜是一類(lèi)分離與分析技術(shù)，其特點(diǎn)是以液體作為流動(dòng)相，固定相可以有多種形式，如紙、薄板和填充床等。在色譜技術(shù)發(fā)展的過(guò)程中，為了區(qū)分各種方法，根據(jù)固定相的形式產(chǎn)生了各自的命名，如，紙色譜、薄層色譜和柱液相色譜。
 
一、對(duì)液相色譜儀的要求
 
⒈流動(dòng)相必須用HPLC級(jí)的試劑，使用前過(guò)濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45μm或更細(xì)的膜過(guò)濾)。
 
⒉流動(dòng)相過(guò)濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。
 
⒊不能用純乙腈作為流動(dòng)相，這樣會(huì)使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進(jìn)液。
 
⒋使用緩沖溶液時(shí)，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，然后用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對(duì)于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20mL以上。
 
⒌長(zhǎng)時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相(如，甲醇等)，因?yàn)椋�純水易長(zhǎng)霉。
 
⒍每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑清洗進(jìn)樣器。
 
⒎C18柱絕對(duì)不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。
 
⒏堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱→混合器中的過(guò)濾器→管路過(guò)濾器→單向閥檢查并清洗，清洗方法：
 
①以異丙醇作溶劑沖洗；
 
②放在異丙醇中間用超聲波清洗；
 
③用10％稀硝酸清洗；
 
⒐氣泡會(huì)致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過(guò)程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。
 
⒑如果進(jìn)液管內(nèi)不進(jìn)液體時(shí)，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相的清洗。
 
⒒要注意柱子的pH值范圍，不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品。
 
⒓更換流動(dòng)相時(shí)應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動(dòng)邊靖洗，然后插入新的流動(dòng)相中。更換無(wú)互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過(guò)渡一下。
 
二、常見(jiàn)故障斷定及解決方法
 
⒈保留時(shí)間變化
 
⑴柱溫變化：柱恒溫，必要時(shí)需配置恒溫箱。
 
⑵等度與梯度間未能充分平衡：至少用10倍柱體積的流動(dòng)相平衡柱。
 
⑶緩沖液容量不夠：用》25mmol/L的緩沖液。
 
⑷柱污染：每天沖洗柱。
 
⑸柱內(nèi)條件變化：穩(wěn)定進(jìn)樣條件,調(diào)節(jié)流動(dòng)相。
 
⑹柱快達(dá)到壽命：采用保護(hù)柱。
 
⒉保留時(shí)間縮短
 
⑴流速增加：檢查泵,重新設(shè)定流速。
 
⑵樣品超載：降低樣品量。
 
⑶鍵合相流失：流動(dòng)相pH值保持在3~7.5檢查柱的方向。
 
⑷流動(dòng)相組成變化：防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀。
 
⑸溫度增加：柱恒溫。
 
⒊保留時(shí)間延長(zhǎng)
 
⑴流速下降：管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡。
 
⑵硅膠柱上活性點(diǎn)變化：用流動(dòng)相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱。
 
⑶鍵合相流失：流動(dòng)相pH值保持在3~7.5檢查柱的方向。
 
⑷流動(dòng)相組成變化：防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀。
 
⑸溫度降低：柱恒溫。
 
⒋出現(xiàn)肩峰或分
 
⑴樣品體積過(guò)大：用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%。
 
⑵樣品溶劑過(guò)強(qiáng)：采用較弱的樣品溶劑。
 
⑶柱塌陷或形成短路通道：更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件。
 
⑷柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效：更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過(guò)濾器,過(guò)濾樣品。
 
⑸進(jìn)樣器損壞：更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子。
 
⒌鬼峰
 
⑴進(jìn)樣閥殘余峰：每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗。
 
⑵樣品中未知物：處理樣品。
 
⑶柱未平衡：重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑 (尤其是離子對(duì)色譜)。
 
⑷三氟乙酸(TFA)氧化(肽譜) ：每天新配,用抗氧化劑。
 
⑸水污染(反相) ：通過(guò)變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用HPLC級(jí)的水。
 
⒍基線噪聲
 
⑴氣泡(尖銳峰) 流動(dòng)相脫氣：加柱后背壓。
 
⑵污染(隨機(jī)噪聲) ：清洗柱,凈化樣品,用HPLC級(jí)試劑。
 
⑶檢測(cè)器燈連續(xù)噪聲：更換氘燈。
 
⑷電干擾(偶然噪聲)：采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來(lái)源(如水浴等)。
 
⑸檢測(cè)器中有氣泡：流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓。
 
⒎峰拖尾
 
⑴柱超載：降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相。
 
⑵峰干擾：清潔樣品,調(diào)整流動(dòng)相。
 
⑶硅羥基作用：加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相PH值,鈍化樣品。
 
⑷柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效：更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過(guò)濾器,過(guò)濾樣品。
 
⑸柱塌陷或形成短路通道：更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件。
 
⑹死體積或柱外體積過(guò)大：連接點(diǎn)降至最低,對(duì)所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整,盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管。
 
⑺柱效下降：用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護(hù)柱。
 
⒏峰展寬
 
⑴進(jìn)樣體積過(guò)大：用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%。
 
⑵在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展L進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散。
 
⑶數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢 : 設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點(diǎn)。
 
⑷檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)過(guò)大 : 設(shè)定時(shí)間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10%。
 
⑸流動(dòng)相粘度過(guò)高 : 增加柱溫,采用低粘度流動(dòng)相。
 
⑹檢測(cè)池體積過(guò)大 : 用小體積池,卸下熱交換器。
 
⑺保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng) : 等度洗脫時(shí)增加溶劑含量也可用梯度洗脫。
 
⑻柱外體積過(guò)大 : 將連接管徑和連接管長(zhǎng)度降至最小。
 
⑼樣品過(guò)載 : 進(jìn)小濃度小體積樣品。

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