Digital PCR 技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用詳述

Digital PCR，綻放正當(dāng)時(shí)！

dPCR發(fā)展歷史

    1992年，Sykes等從非淋巴細(xì)胞和正常體細(xì)胞背景中鑒定突變的白血病細(xì)胞，檢測(cè)了復(fù)雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因。該研究中提出了三個(gè)重要的原則：有限稀釋、終點(diǎn)信號(hào)的有或無(wú)及對(duì)數(shù)據(jù)泊松分布的統(tǒng)計(jì)處理，為以后dPCR的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

    1997年，有研究利用玻璃毛細(xì)管作為載體進(jìn)行PCR反應(yīng)，可以對(duì)模板分子進(jìn)行定量，驗(yàn)證了Taq-Man探針可以檢測(cè)模板單分子，尤其在微小的反應(yīng)體系中，發(fā)展了單分子定量技術(shù)，為dPCR單模板擴(kuò)增提供了技術(shù)支持。

    1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W. Kinzler正式提出了dPCR的概念，他們?cè)诮Y(jié)腸癌患者糞便中檢測(cè)KRAS基因突變時(shí)，首先把樣本分配到384孔板中，然后分別用不同熒光檢測(cè)突變基因和正常基因，通過(guò)計(jì)算突變基因和正�；�因的比例來(lái)得出突變率。

    2003 年 Dressman 等 發(fā) 明 了 一 種BEAMing 方法(珠子、乳劑、擴(kuò)增與磁力) 。BEAMing 將模板、引物、PCR 試劑和磁珠的混合物分至小滴中，其中大多數(shù)的小滴不含有或只含有一個(gè)模板。PCR 完成后，其中擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)通過(guò)生物素——鏈酶親和素的鍵合關(guān)聯(lián)在磁珠上，乳化物隨之會(huì)被打散，珠子就能通過(guò)與檢測(cè)寡核苷酸和流式細(xì)胞儀的雜交物所讀取。

    2006年 Fluidigm公司推出了第一臺(tái)基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)。隨后，QuantaLife 利用油包水微滴生成技術(shù)開(kāi)發(fā)了微滴式數(shù)字PCR技術(shù)。2011年，QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收購(gòu)，其微滴式數(shù)字PCR儀產(chǎn)品更名為QX100型號(hào)儀，2013年該公司又推出了升級(jí)型號(hào)QX200。2013年下半年，Life-technologies推出了QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)。

 

商業(yè)化數(shù)字PCR平臺(tái)的概述

類(lèi)型	供應(yīng)商	生產(chǎn)時(shí)間	儀器型號(hào)	分液數(shù)目	特點(diǎn)
芯片式	Fluidigm	2006	EP1	36,960	基于集成流體通路芯片，快速準(zhǔn)確地將流體分成獨(dú)立的單元。操作耗時(shí)，反應(yīng)成本高。
		2006	BioMark HD	9180
	Life Technologi-es	2009	Open Array	3072	反應(yīng)重復(fù)的數(shù)量可輕松調(diào)整，以滿足應(yīng)用需求。 樣品之間完全隔離，防止交叉污染。反應(yīng)的通量 較低。
		2009	QuantStudio 12K Flex	3072
		2013	QuantStudio 3D	20,000
微滴式	Bio-Rad	2011	QC100	20,000	基于油包水技術(shù)，大量的微滴提供了足夠的精確度，能準(zhǔn)確測(cè)定樣品拷貝數(shù)�？赏瑫r(shí)進(jìn)行96個(gè)樣本反應(yīng)。
		2013	QX200	20,000
	RainDance	2012	RainDrop	10,000,000	皮升級(jí)反應(yīng)微滴，提供更高的檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍，適用于處理更大濃度差異的不同樣品。

基本原理

    dPCR的原理是將含有核酸模板的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系，平均分配成上萬(wàn)個(gè)和數(shù)百萬(wàn)個(gè)PCR 反應(yīng)，分配到芯片或微滴中，使每個(gè)反應(yīng)中盡可能含有一個(gè)模板分子，進(jìn)行單分子模板PCR反應(yīng)，利用標(biāo)記的探針檢測(cè)特定的靶序列,通過(guò)讀取熒光信號(hào)的有或無(wú)，計(jì)算兩種信號(hào)類(lèi)型的反應(yīng)單元比例和數(shù)目，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)泊松分布的校準(zhǔn)進(jìn)行絕對(duì)定量。

    根據(jù)數(shù)字PCR 反應(yīng)單元總數(shù)和有熒光信號(hào)的單元數(shù)以及樣品的稀釋倍系數(shù),就可以得到樣本的最初拷貝數(shù)(濃度)。

    不同于 qPCR對(duì)每個(gè)循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光測(cè)定的方法，dPCR 技術(shù)是在擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行采集，最后根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。

    根據(jù)大量獨(dú)立反應(yīng)單元實(shí)現(xiàn)方式的不同，dPCR又細(xì)分為基于液滴式微流控（droplet microfluidics）的微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）和基于芯片式微流控的微陣列芯片式數(shù)字PCR（chip digital PCR，cdPCR）。

 

微流控芯片數(shù)字PCR

    隨著微流芯片技術(shù)的發(fā)展，數(shù)字 PCR 借助微流芯片，可以把樣本準(zhǔn)確并且快速的分成若干個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)單元，各個(gè)單元之間互不影響，可以多步反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。提高反應(yīng)通量的同時(shí)也降低了反應(yīng)消耗成本。目前Fluidigm公司的Bio-Mark ^TM 基因分析系統(tǒng)，Life Technologies公司QuantStudio ^TM 3D數(shù)字 PCR系統(tǒng)均均為采用微流控芯片技術(shù)的數(shù)字PCR系統(tǒng)。

                  

 

液滴數(shù)字PCR

    數(shù)字PCR源于乳液PCR(emulsion PCR)技術(shù) ，利用微滴發(fā)生器可以一次生成數(shù)萬(wàn)乃至數(shù)百萬(wàn)個(gè)納升甚至皮升級(jí)別的單個(gè)油包水微滴,作為數(shù)字PCR的樣品分散載體，PCR反應(yīng)結(jié)束后檢測(cè)每個(gè)微滴的熒光信號(hào)。目前Bio-Rad公司的QX100系統(tǒng)、 QX200系統(tǒng)均為采用液滴技術(shù)的數(shù)字PCR系統(tǒng)。

                

 

數(shù)字PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR的比較

方法	原理	應(yīng)用	優(yōu)點(diǎn)	缺點(diǎn)
數(shù)字PCR	將PCR反應(yīng)體系進(jìn)行分液，PCR擴(kuò)增，通過(guò)統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性反應(yīng)和陰性反應(yīng)的數(shù)目，直接得出樣品的拷貝數(shù)	病毒載量的絕對(duì)定量；拷貝數(shù)變異分析；罕見(jiàn)突變的檢測(cè)；基因表達(dá)定量；二代測(cè)序文庫(kù)分析等	絕對(duì)定量，不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，靈敏度高，對(duì)PCR反應(yīng)抑制劑的耐受能力更 強(qiáng)	檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍要小，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性，成本較高
實(shí)時(shí)熒光定量PCR	擴(kuò)增產(chǎn)物的量與熒光信號(hào)強(qiáng)度成正比，通過(guò)反應(yīng)的循環(huán)閾值及標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)樣品定量	病原體的檢測(cè)與定量；基因表達(dá)的相對(duì)檢測(cè)；單核苷酸多態(tài)性分析；腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)等	檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍廣，應(yīng)用范圍廣，成本較低	擴(kuò)增效率易受PCR反應(yīng)抑制劑的影響

應(yīng)用

dPCR技術(shù)具有以下的優(yōu)勢(shì)：

(1)高靈敏度。dPCR本質(zhì)上將一個(gè)傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)變成了數(shù)萬(wàn)個(gè)PCR反應(yīng)，在這數(shù)萬(wàn)個(gè)反應(yīng)單元中分別獨(dú)立檢測(cè)目的序列，從而大大提高了檢測(cè)的靈敏度。

(2)高精確度。dPCR通過(guò)計(jì)算在數(shù)萬(wàn)個(gè)反應(yīng)單元中陽(yáng)性反應(yīng)單元數(shù)量和比例，可以精確地檢測(cè)出變化很小的目的序列差異。

(3)高耐受性。dPCR技術(shù)第一步反應(yīng)體系分配的過(guò)程，可以使背景序列和PCR反應(yīng)抑制物被均勻分配到每個(gè)反應(yīng)單元，而大部分反應(yīng)單元中并不含有目的序列，低豐度的目的序列被相對(duì)富集于某些反應(yīng)單元中，從而顯著地降低了這些反應(yīng)單元中背景序列和抑制物對(duì)反應(yīng)的干擾。另外，dPCR在對(duì)每個(gè)反應(yīng)單元進(jìn)行結(jié)果判讀時(shí)僅判斷陽(yáng)性／陰性?xún)煞N狀態(tài)，不依賴(lài)于Ct值，受擴(kuò)增效率的影響大為降低，對(duì)背景序列和抑制物的耐受能力也大大提高。

 (4)絕對(duì)定量。PCR直接計(jì)算目的序列的拷貝數(shù)，無(wú)需依賴(lài)于Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以進(jìn)行精確的絕對(duì)定量檢測(cè)。

dPCR的以上優(yōu)點(diǎn)使其特別適合于以下方面的應(yīng)用：

領(lǐng)域	應(yīng)用實(shí)例
臨床診斷	無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷
	癌癥標(biāo)志物檢測(cè)
	病毒檢測(cè)
	拷貝數(shù)變異分析
	稀有突變檢測(cè)
基因表達(dá)分析	復(fù)雜樣品基因表達(dá)分析
	單細(xì)胞基因表達(dá)分析
下一代測(cè)序	測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證
	測(cè)序文庫(kù)質(zhì)控
基因成分定量	轉(zhuǎn)基因成分分析
微生物檢測(cè)	水樣微生物檢測(cè)
	病原微生物檢測(cè)

    dPCR作為核酸定量的新技術(shù)，與此前的核酸定量方法相比，方法的靈敏度、準(zhǔn)確度更高。dPCR為分子生物學(xué)、微生物學(xué)等領(lǐng)域提供了新的檢測(cè)方法和實(shí)驗(yàn)思路。從應(yīng)用的范圍、實(shí)驗(yàn)的成本角度來(lái)看，dPCR不可能完全取代qPCR，但是dPCR方法可以進(jìn)行精準(zhǔn)的絕對(duì)定量分析，極好的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性，而且樣本需求較低，在核酸檢測(cè)與定量等方面有非常重要的補(bǔ)充。在整個(gè)dPCR的發(fā)展過(guò)程中，應(yīng)用越來(lái)越廣泛，在核酸檢測(cè)定量、抗病毒治療監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷具有重要的意義。隨著dPCR技術(shù)和商品化平臺(tái)的發(fā)展，dPCR的通量將會(huì)更高，成本更低，在科學(xué)研究領(lǐng)域?qū)��?huì)發(fā)揮更重要的作用。

 

參考文獻(xiàn)

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4. 馮兆民,舒躍龍. 數(shù)字PCR技術(shù)及其應(yīng)用進(jìn)展[J]. 病毒學(xué)報(bào) Vol. 33 No. 1 January 2017.
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