采用試劑盒因子法體外培養(yǎng)NK細(xì)胞的方法

1.NK細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒包含：
①無血清培養(yǎng)基2瓶（l000mL/瓶）：
②NK試劑A, 1支：
③NK試劑B, 1支：
④NK試劑C, 1支:
⑤NK試劑D, 1支：
⑥NK試劑E, 1支：
培養(yǎng)體系中需用到2支（100萬IU/支）rH IL-2
2.原材料
1.采取外周血（可從臍血、骨髓等組織）
2.需的試劑耗材包括：
0.4%苔盼藍(lán)溶液、生理鹽水、人淋巴細(xì)胞分離液（建議選用GE）、175cm²培養(yǎng)瓶、GT-T610 （A）培養(yǎng)袋、15ral/50ml/250ml離心管、移液管、1毫升無菌注射器
3.NK細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間過程:
前一天：要提前處理好細(xì)胞活化瓶（NK試劑A）
第1天：進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞分離與誘導(dǎo)(NK試劑B）
第3天：NK細(xì)胞第一次補(bǔ)液，補(bǔ)液50ml（NK試劑C）
第5天:NK細(xì)胞第二次補(bǔ)液，補(bǔ)液175ml (NK試劑D）
第7天：NK細(xì)胞第三次補(bǔ)液，裝袋并補(bǔ)液500ml (NK試劑E)
第9-10天：NK細(xì)胞第四次補(bǔ)液，分袋并補(bǔ)液750ml
第12天：NK細(xì)胞第五次補(bǔ)液.補(bǔ)液500ml
第13天：檢菌
第14、15天：培養(yǎng)成功
（細(xì)胞培養(yǎng)成功時(shí)間視具體細(xì)胞生長情況而定，在保持培培養(yǎng)基ph和細(xì)胞活力正常的情況下也可以多培養(yǎng)一天）
4.具體操作步驟如下：
1.頭一天一定要先處理細(xì)胞活化瓶。
2.將NK試劑A （4度保存）加入到含有12.5ml生理鹽水的175cm²底面積細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，充分的混勻 30秒-1分鐘,使液體充分在瓶底分散，4度冰箱平放過夜
(NK試劑A需要和生理鹽水充分混勻平鋪在瓶底；次日取出后直接吸棄液體即可，無需清洗）
3.外周血單個(gè)核細(xì)胞分離與誘導(dǎo)（第1天）
4.以100ml外周血為例，如血量不同，也可按操作規(guī)程做相應(yīng)調(diào)整。
5.將患者外周血，用移液訝吸取少許原血（約300 ul）劃線或滴入平皿過行檢菌。然后，正常室溫下,進(jìn)行離心。
6.將上層血漿轉(zhuǎn)入離心，滅活，離心，取上清液備用。
7.使用等體積的生理鹽水與血細(xì)胞沉淀混勻后，小心加到Ficoll層上，使分層保持清晰。室溫內(nèi)進(jìn)行離心。
8.吸取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC）層，盡量吸盡兩液面交接處的細(xì)胞層.加生理鹽水吹打混勻，離 心。相同方法冉次洗滌細(xì)胞。
9.棄去上清后，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,吸取少量細(xì)胞計(jì)數(shù)。
10.按照細(xì)胞密度為1-2*10^6個(gè)/ml(最優(yōu)為5 *10^6個(gè)/ml）,用培養(yǎng)基清洗離心管，并入培養(yǎng)瓶內(nèi)，并加入1支NK試劑B，患者滅活血漿1.25ml (5%）確保培養(yǎng)基終體積為25ml左右。剩余血漿4°C 密封保存?zhèn)溆谩?br />     注：包被瓶取出時(shí)間為細(xì)胞加入前5分鐘,其他時(shí)間需在4度放置備用。
    試劑A、B、C、D、E的取用.違議第一次吸取原液后.以適貴培養(yǎng)基沖洗西林瓶后再吸出，以最大程度減少損耗
11.活化培養(yǎng)基的配置：其中1瓶無血清培養(yǎng)基中，加入100萬IU的IL-2，終濃度為1000IU/mL。
      注：活化培養(yǎng)基每次使用前恢復(fù)至室溫。
12.NK細(xì)胞的第一補(bǔ)液（第3天），補(bǔ)加含有5%的患者滅活血漿和NK試劑C，確保培養(yǎng)的終體積為 75mL。
13.NK細(xì)胞的第二次補(bǔ)液（第5天），補(bǔ)加含有5%的患者滅活血漿和NK試劑D,確保培養(yǎng)的終體積為 250ml.
14.NK細(xì)胞的第三次補(bǔ)液及其裝袋（第7天），細(xì)胞轉(zhuǎn)袋前將培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞進(jìn)行輕微吹散細(xì)胞，隨后將培養(yǎng)瓶的中的細(xì)胞懸液及其500mL活化培養(yǎng)基，裝入到細(xì)胞培養(yǎng)袋中，同時(shí)加入1支NK試劑E，及其剩余的全部血漿，確保終體積為750ml。
15.NK細(xì)胞的第四次補(bǔ)液（第9天），主要為分袋操作，將培養(yǎng)體系由750ml擴(kuò)增至1500ml。
16.NK細(xì)胞的第五次補(bǔ)液（第!2天）.主要為補(bǔ)液操作，將剩余的500mL擴(kuò)增液均分到2個(gè)培養(yǎng)袋中，確保每袋體積為1000ml。
17.檢菌，細(xì)胞培養(yǎng)第13天，對細(xì)胞懸液進(jìn)行檢菌、內(nèi)毒素檢測。用5ml注射器分別從培養(yǎng)瓶和袋內(nèi)抽取少最細(xì)胞懸液，加入正置的平皿中，放入35℃恒溫生化培養(yǎng)箱， 記錄放入日期及培養(yǎng)物品。隔夜后倒置，保留48小時(shí)。
18.收獲，正常情況下，第13, 14天各收獲1000ml細(xì)胞懸液。若因臨床需要進(jìn)行提前或延遲回輸，也可相應(yīng)提前或延遲。（NK細(xì)胞建議2-4h之內(nèi)使用，以保證其活性）