Southern blot檢測(cè)技術(shù)在模式動(dòng)物制備中的應(yīng)用‍

圖1. Edwin Southern^[7]

（埃德溫·邁勒·薩瑟恩）

Southern blot 實(shí)驗(yàn)原理及步驟‍

了解了Southern 的由來(lái)，接下來(lái)小編帶大家一起學(xué)習(xí)Southern blot實(shí)驗(yàn)原理及步驟。

Southern blot基本原理：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補(bǔ)的原則特異性地雜交形成雙鏈。其操作過(guò)程是利用特定酶將DNA消化成片段，再進(jìn)行電泳分離，然后將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的DIG標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測(cè)特定DNA片段分子的含量（見圖2）^[2]。

blot 操作過(guò)程^[2]

 

Southern blot

檢測(cè)技術(shù)在模式動(dòng)物制備中的應(yīng)用‍
 

雖然距離這項(xiàng)技術(shù)發(fā)明已經(jīng)過(guò)去很多年，但這項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)仍被廣泛的應(yīng)用在各種生物實(shí)驗(yàn)研究中。

如下圖所示，為了鑒定攜帶條件性Satb1等位基因的供體質(zhì)粒通過(guò)同源重組方式整合到小鼠的Satb1特異性位點(diǎn)上（見圖3a），研究者們提取供體小鼠與wild小鼠肝臟基因組DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Eco RV (b) or Spe I (c,d)酶切，同時(shí)選擇用于Southern印跡分析的DNA探針。探針位于待靶向的基因中，但在靶向載體外部設(shè)計(jì)5’與3’外源探針（5’ external probe與3’external probe）以及內(nèi)源eGFP探針（GFP internal probe）。通過(guò)Southern blot檢測(cè)顯示，5’與3’外源探針?lè)謩e與酶切后對(duì)應(yīng)基因組片段發(fā)生雜交，說(shuō)明供體質(zhì)粒在5’與3’端與靶基因組同源重組（見圖3b，d），與預(yù)期插入位置一致；經(jīng)內(nèi)源eGFP探針雜交顯示為一條帶，說(shuō)明條件性Satb1等位基因以單拷貝插入到靶基因座上（見圖3c）。^[3]

圖3. Southern blot分析鑒定供體質(zhì)粒靶向小鼠Satb1 基因座及拷貝數(shù)^[3]

那么既然說(shuō)是同源重組“事件”，對(duì)于“事件”肯定有很多不確定性。如圖4A所示，5’與3’同源臂均發(fā)生同源重組后，可將靶載體正確的插入到目的基因組中，獲得研究所需的目的片段。當(dāng)然，有的時(shí)候也會(huì)出現(xiàn)異常情況（見圖4B），比如同源重組僅發(fā)生在5’末端，但3’末端沒(méi)有發(fā)生同源重組，而是直接被插入至基因組中。在這種情況下，5’外源探針顯示靶向等位基因片段符合預(yù)期，但3’端顯示為野生型片段。此時(shí)，如果不通過(guò)設(shè)計(jì)同源臂外兩側(cè)DNA探針策略來(lái)驗(yàn)證同源重組是否正確，這很大程度上會(huì)增加后續(xù)研究的風(fēng)險(xiǎn)性。^[4]

圖4. Southern blot鑒定同源重組事件^[4]

另外，在制備基因敲進(jìn)和條件性基因敲除模式小鼠過(guò)程中，Southern blot檢測(cè)是非常重要的一步。在我們以往的工作中，其中一例Cre定點(diǎn)敲進(jìn)課題（如圖5），Southern blot檢測(cè)結(jié)果顯示：小鼠1號(hào)，有明顯的隨機(jī)插入現(xiàn)象。

圖5. Southern blot 檢測(cè)定點(diǎn)敲進(jìn)

Southern blot檢測(cè)技術(shù)雖不是萬(wàn)能的，但絕對(duì)是金標(biāo)準(zhǔn)！

也有人會(huì)說(shuō)：既然是隨機(jī)插入，很可能插入在不同染色體，理論上就完全可以通過(guò)后續(xù)交配稀釋或去除，那再多交配一代是不是就可以稀釋甚至去除隨機(jī)插入呢？

讓我們看看事實(shí)是怎樣的：依據(jù)我們大量的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，采用ES細(xì)胞方式制備，大約有20%的概率有隨機(jī)插入，由于ES細(xì)胞法制備中可以在細(xì)胞這一步就進(jìn)行Southern鑒定，進(jìn)入下一批小鼠制備的ES細(xì)胞可以確保為Southern陽(yáng)性；而采用CRISPR/Cas9技術(shù)，隨機(jī)插入的概率約32%，不同的是用CRISPR/Cas9就直接得到了小鼠，只能在小鼠水平篩除隨機(jī)插入。而這32%中有14%的隨機(jī)插入是無(wú)法靠交配傳代去除的（見圖6）。是否“隨機(jī)插入”不是真的“隨機(jī)”的呢？是不是像轉(zhuǎn)基因一樣，更多的情況是打靶載體或插入序列，會(huì)容易在目的插入位點(diǎn)插入多個(gè)拷貝，造成同一染色體/同一位點(diǎn)的多拷貝“隨機(jī)”插入呢？^[8] 我們沒(méi)有詳細(xì)做過(guò)調(diào)研，但是接近一半可分離的隨機(jī)插入比例，預(yù)示了有這種可能。而此時(shí)，只能通過(guò)Southern blot對(duì)基因組DNA特定序列定位，進(jìn)而排除隨機(jī)插入的風(fēng)險(xiǎn)。^[5-6]

   因此，Southern blot雖然有它自己的限制，如費(fèi)用高，片段有技術(shù)極限等，但仍然是模式動(dòng)物制備檢測(cè)隨機(jī)插入的金標(biāo)準(zhǔn)！

圖6. 隨機(jī)插入的概率分析^[5]

百奧賽圖自主開發(fā)的基于C57BL/6小鼠胚胎干細(xì)胞的基因編輯系統(tǒng)具有獨(dú)特的品系優(yōu)勢(shì)，CRISPR/Cas9技術(shù)自主研發(fā)的EGE^Ⓡ系統(tǒng)將同源重組率提高近20倍，并且一直堅(jiān)持PCR/DNA測(cè)序和Southern blot鑒定雙重質(zhì)控。目前基因改造大小鼠及細(xì)胞系年制備能力>1500項(xiàng)，靈長(zhǎng)類動(dòng)物4種。歡迎小伙伴們前來(lái)咨詢及合作！
 

[1] https://en.wikipedia.org/wiki/Southern_blot

[2] Nelson, D.L, Cox, M.M.Lehningers Principles of Biochemistry, 5th edition. 2008

[3] Sommer D, et al.Efficient genome engineering by targeted homologous recombination in mouse embryos using transcription activator-like effector nucleases. Nat Commun.2014;5:3045.

[4] http://ko.cwru.edu/info/targvect design.html

[5] http://www.sohu.com/a/24558079 3_227596

[6] http://www.bbctg.com.cn/index/index/knowledge/id/52.html

[7] https://baike.baidu.com/item/southern blot

[8] Ng P, et al. The Molecular Basis of Multiple Vector Insertion by Gene Targeting in Mammalian Cells. Genetics.1999 Mar;151(3):1143-55.