Science Immunology：狙擊腫瘤，PD-1與GITR抗體聯(lián)用竟有事半功倍之妙！
2018年11月，也就是本月初，在Science Immunology期刊中刊登的一篇為Combination cancer immunotherapy targeting PD-1and GITR can rescue CD8+ T cell dysfunction and maintain memory phenotype文章中，表明聯(lián)合使用抗PD-1抗體和抗GITR抗體促進(jìn)淋巴細(xì)胞抗癌效果的機(jī)制。這種組合療法能夠顯著提高CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)子功能。它通過提高一種名為CD226的共刺激通路活性，刺激一種能夠迅速增殖的效應(yīng)記憶T細(xì)胞前體的產(chǎn)生。這項(xiàng)研究揭示GITR抗體和PD-1抗體組合提高T淋巴細(xì)胞抗癌功能的分子機(jī)理，支持在臨床試驗(yàn)中繼續(xù)檢驗(yàn)這種組合療法的抗癌效果。下面小編帶著大家簡(jiǎn)單回顧一下這篇文章~
抗PD-1抗體與抗GITR抗體的聯(lián)合治療
以協(xié)同方式抵抗腫瘤生長(zhǎng)
以及瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞的功能障礙
首先研究者利用小鼠結(jié)腸癌模型評(píng)價(jià)抗PD-1抗體、抗GITR抗體以及抗PD-1抗體與抗GITR抗體聯(lián)用這三種方式的治療效果，發(fā)現(xiàn)抗PD-1抗體與GITR抗體聯(lián)合治療可顯著提高荷瘤小鼠生存期（如圖1A），此治療主要依賴CD8+ T細(xì)胞對(duì)腫瘤進(jìn)行作用（如圖1B）。同時(shí)抗PD-1抗體與抗GITR抗體聯(lián)合作用可提高瘤內(nèi)效應(yīng)T細(xì)胞/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比率（如圖1C-D），促進(jìn)瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞的增殖（如圖1E-G）。
圖1. PD -1抗體與GITR抗體的聯(lián)合用藥可協(xié)同抑制小鼠腫瘤，降低T細(xì)胞功能障礙
在腫瘤免疫治療過程中，應(yīng)用單細(xì)胞測(cè)序是一種非常重要的研究方法。單細(xì)胞RNA測(cè)序能夠獨(dú)立地提供每個(gè)細(xì)胞的RNA表達(dá)譜，并鑒定異質(zhì)細(xì)胞群中的稀有細(xì)胞。由于在抗體藥免疫治療過程中，腫瘤組織內(nèi)會(huì)出現(xiàn)TILs（腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞），進(jìn)而在癌組織及周邊形成復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，這種微環(huán)境是腫瘤免疫治療的關(guān)鍵。而僅對(duì)這些免疫細(xì)胞表型進(jìn)行簡(jiǎn)單分析，很難獲免疫治療長(zhǎng)效性的機(jī)制，因此只有開展單細(xì)胞水平的RNA研究才能獲得詳盡的腫瘤免疫圖譜，為發(fā)現(xiàn)抗體藥靶點(diǎn)治療機(jī)制以及潛在新的腫瘤靶點(diǎn)提供數(shù)據(jù)支撐。
通過先進(jìn)的單細(xì)胞TCR測(cè)序技術(shù)，分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)抗PD-1/GITR抗體聯(lián)合免疫治療后，
克隆擴(kuò)增的CD8+ T細(xì)胞群具有獨(dú)特的基因表型特征
為了更好的進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)探索，研究者們?cè)O(shè)計(jì)了一套實(shí)驗(yàn)進(jìn)行單細(xì)胞TCR測(cè)序分析，首先荷瘤小鼠在第6天接受抗體藥物治療，在治療后的第2天與第5天，取腫瘤細(xì)胞和脾臟，流式分選CD8+T細(xì)胞，通過Fluidigm公司C1系統(tǒng)進(jìn)行單細(xì)胞TCR測(cè)序（圖2A）。如圖2B所示，通過對(duì)T細(xì)胞功能障礙和激活相關(guān)的452個(gè)基因進(jìn)行分析，繪制熱圖分為6組，P值以0.05為界限，P值越小，對(duì)應(yīng)基因表達(dá)譜差異性越顯著，數(shù)據(jù)顯示抗PD-1抗體與抗GITR抗體聯(lián)合治療主要在熱圖的第6組，同時(shí)說明不同抗體治療作用CD8+ T細(xì)胞所表現(xiàn)出的基因圖譜是不同的。
如圖2C所示，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抗PD-1抗體、抗GITR抗體以及抗PD-1抗體與抗GITR抗體聯(lián)用這三種方式，均可以上調(diào)T細(xì)胞活化的標(biāo)志物IL-12rb，與單個(gè)抗體藥物治療不同的是，抗PD-1抗體與抗GITR抗體聯(lián)合治療可選擇性的抑制一系列促T細(xì)胞功能性障礙相關(guān)基因（Mt1，Mt2和Cd200等）的上調(diào)，并大幅度上調(diào)Cd226基因，一種抗腫瘤反應(yīng)中重要的共刺激分子。圖2C中紅色、紫色、藍(lán)色圓點(diǎn)分別代表PD-1抗體與GITR抗體聯(lián)用、PD-1抗體、GTIR抗體治療過程中，CD8+T細(xì)胞群特殊上調(diào)的表型基因。在這個(gè)過程中，CD8+ T 細(xì)胞群呈現(xiàn)出不同表型基因的上調(diào)，橫縱坐標(biāo)分別代表基因活性積分與功能障礙積分，橫坐標(biāo)越往右側(cè)，與T細(xì)胞活化相關(guān)基因上調(diào)越明顯。通過圖2D整合分析進(jìn)一步說明，PD-1抗體與GITR抗體聯(lián)用和單一抗體治療相比較，聯(lián)合治療對(duì)T細(xì)胞活化相關(guān)基因有明顯的上調(diào)作用。
圖2. 單細(xì)胞測(cè)序繪制CD8+ T細(xì)胞獨(dú)特的基因圖譜及分析
進(jìn)一步研究揭示，抗PD-1抗體與抗GITR抗體聯(lián)合免疫治療介導(dǎo)形成獨(dú)特的腫瘤特異性CD8+ T細(xì)胞群
如圖3A所示，取經(jīng)抗PD-1抗體、抗GITR抗體以及兩種抗體聯(lián)合分別處理的荷瘤小鼠，在處理后的9天和12天，取瘤內(nèi)T細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)maker標(biāo)記（PD-1、TIM3、LAG3、KLRG1，CD244和CD44），根據(jù)不同標(biāo)記物的表達(dá)情況，繪制瘤內(nèi)T細(xì)胞群。結(jié)果顯示，經(jīng)抗GITR抗體，抗PD-1抗體與GITR抗體聯(lián)合治療后，抗原特異性CD8+ T細(xì)胞在T細(xì)胞的不同分化階段表現(xiàn)出一定的異質(zhì)性。將各maker異質(zhì)性細(xì)胞群密度圖整合分析，發(fā)現(xiàn)形成的14號(hào)12號(hào)和7號(hào)細(xì)胞集群對(duì)PD-1抗體和GITR抗體聯(lián)合治療具有高度響應(yīng)，同時(shí)揭示14號(hào)細(xì)胞集群的出現(xiàn)預(yù)示T細(xì)胞功能障礙到達(dá)終點(diǎn)（早期并未形成14號(hào)細(xì)胞集群）（如圖3B-G）。
圖3. 抗體聯(lián)合治療后，對(duì)功能性障礙的腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+ T細(xì)胞群的鑒定
雖然經(jīng)過以上研究，發(fā)現(xiàn)了腫瘤特異性CD8+ T細(xì)胞群，但這并不能說明PD-1抗體與GITR抗體聯(lián)合治療的長(zhǎng)效性。
為了找到抗體聯(lián)合治療的長(zhǎng)效性的原因，研究者們隨后對(duì)T細(xì)胞群進(jìn)行表征分析，利用更多的T 活化與分化過程中的標(biāo)志物對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，做深度剖析（圖4A-B）。經(jīng)SPADE集群分析顯示（圖4C-E），由抗GITR抗體驅(qū)動(dòng)的免疫聯(lián)合治療12天后，瘤內(nèi)出現(xiàn)了特殊的記憶性細(xì)胞群，此細(xì)胞群的形成標(biāo)志著獲得性免疫的開啟，維持抗體聯(lián)合免疫治療的長(zhǎng)效性（圖4F-G）。
圖4. 抗體聯(lián)合治療后，對(duì)記憶性CD8+ T細(xì)胞群的鑒定
到目前研究節(jié)點(diǎn)上，我們已經(jīng)了解到，雖然PD-1抗體很少引起T細(xì)胞功能障礙，但卻不能保持免疫治療的長(zhǎng)效性。而GITR抗體與PD-1抗體的聯(lián)合免疫治療中，瘤內(nèi)出現(xiàn)了記憶性的CD8+ T細(xì)胞群解釋了先前研究者對(duì)聯(lián)合療法長(zhǎng)效性的困惑。
在抗PD-1/GITR聯(lián)合療法中CD226廣泛表達(dá)在腫瘤特異性的CD8+T細(xì)胞群中
為了進(jìn)一步研究抗PD-1抗體與抗GITR聯(lián)合療法協(xié)同作用于CD8+T細(xì)胞群的內(nèi)在機(jī)制，科學(xué)家們開始對(duì)前文提到的CD226共刺激分子的表達(dá)進(jìn)行深度研究。如圖5A所示，在經(jīng)兩種抗體聯(lián)合治療后，CD226 mRNA在腫瘤內(nèi)不同的CD8+T細(xì)胞群上廣泛性存在。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PD-1抗體治療的MC38小鼠模型，其脾細(xì)胞中的抗原卵白蛋白（OVA）特異性的CD8+T表達(dá)的CD226蛋白質(zhì)最高，說明在抗腫瘤過程中，PD-1抗體的治療對(duì)驅(qū)動(dòng)CD226表達(dá)的抗原特異性T細(xì)胞發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用（圖5B）。
如上文提到PD-1抗體治療中擁有這么關(guān)鍵的作用，那么PD-1信號(hào)通路與CD226之間會(huì)存在怎樣的聯(lián)系呢？與已確定的PD-1–SHP2 脫磷酸化靶點(diǎn)CD28（共刺激受體）比較，在淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（LFA-1）存在情況下，CD226可通過PD-1–SHP2進(jìn)行劑量依賴性脫磷酸化（圖5C）。PD-1抗體處理組結(jié)果顯示，CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）中CD266出現(xiàn)高度的磷酸化現(xiàn)象，而對(duì)照組CD266無磷酸化出現(xiàn)，說明瘤內(nèi)PD-1/PD-L1通路在CD8+T細(xì)胞對(duì)CD266起負(fù)調(diào)控作用。以上數(shù)據(jù)揭示CD266是PD-1–SHP2脫磷酸作用的另一位關(guān)鍵靶點(diǎn)。（如圖5D-E）
圖5. 在小鼠MC38腫瘤模型上進(jìn)行抗PD-1與抗GITR抗體聯(lián)合治療中，CD226介導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)的研究
為了進(jìn)一步驗(yàn)證CD266是抗PD-1與抗GITR抗體聯(lián)合療法中介導(dǎo)抗腫瘤的關(guān)鍵因素，研究者在CD266抑制劑處理過的荷瘤小鼠以及CD266基因敲出的荷瘤小鼠身上應(yīng)用抗PD-1抗體與抗GITR抗體聯(lián)合療法，結(jié)果此療法并未發(fā)揮抗腫瘤活性，也沒有改善小鼠的生存期（圖5G），而通過阻斷TNFR超家族信號(hào)途徑和CD28分子均未影響兩種抗體聯(lián)合療法的抗腫瘤作用。這為CD266在PD-1抗體與GITR抗體聯(lián)合療法中介導(dǎo)抗腫瘤作用提供了有力證據(jù)。
當(dāng)然一切好的科研成果一定是基于大量的實(shí)驗(yàn)研究的，這不，科學(xué)家們隨后用RECNA（小鼠腎癌）模型進(jìn)一步驗(yàn)證CD266分子在抗PD-1與抗GITR抗體聯(lián)合治療中的關(guān)鍵性作用，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示與前文MC38小鼠模型上研究得到的結(jié)論高度吻合（圖6）。
圖6.在小鼠RECNA腎癌模型上進(jìn)行PD-1/GITR抗體聯(lián)合治療中，CD226介導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)的研究
好了，以上就是對(duì)本文做的簡(jiǎn)要回顧。
總結(jié)起來，雖然PD-1抗體與GITR抗體各成一派，但兩者卻又強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，其聯(lián)合治療過程中不僅提高CD266活化表達(dá)，并且有效的促進(jìn)效應(yīng)記憶細(xì)胞的增殖，維持抗腫瘤的長(zhǎng)效性，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。
而這些耀眼的數(shù)據(jù)，令人驚嘆的結(jié)果都是基于科學(xué)的研究方法和有力的小鼠模型。
百奧賽圖已經(jīng)自主開發(fā)出B-hPD-1/B-hGITR雙免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠，并在此前的研究工作中分別對(duì)單免疫檢查點(diǎn)B-hPD-1和B-hGITR人源化小鼠進(jìn)行了大量體內(nèi)相關(guān)藥效驗(yàn)證（如圖7，8）。B-hPD-1/B-hGITR更適合對(duì)人的PD-1抗體與GITR抗體藥物進(jìn)行體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)（目前正在進(jìn)行藥效驗(yàn)證），并且文章中提到的藥效動(dòng)力學(xué)中的TILs研究也是本公司特色的體外檢測(cè)服務(wù)平臺(tái)之一。如有需要，歡迎小伙伴們前來咨詢及合作！
圖7. PD-1(Keytruda)抗體與化療藥物聯(lián)用體內(nèi)藥效
將小鼠結(jié)腸癌MC38細(xì)胞（人源化PD-L1并去除小鼠PD-L1）移植到B-hPD-1純合小鼠體內(nèi)建立皮下腫瘤模型，待腫瘤體積約150±50mm3時(shí)將動(dòng)物分組(n=8)。
結(jié)果顯示：抗人PD-1抗體Keytruda和化療藥物Cisplatin聯(lián)合用藥組與單獨(dú)用藥組相比表現(xiàn)出更為明顯的腫瘤抑制效果，證明B-hPD-1小鼠是評(píng)估人PD-1抗體與化藥聯(lián)合用藥體內(nèi)藥效的有力工具。 A. 腫瘤平均體積±SEM，B. 小鼠平均體重±SEM。
圖8.利用B-hGITR小鼠進(jìn)行抗人GITR抗體藥效驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞MC38移植到B-hGITR雜合小鼠皮下，待腫瘤體積約150±50mm3時(shí)將動(dòng)物入組至對(duì)照組和治療組(n=6) 。
結(jié)果顯示：相同劑量下，不同抗人GITR抗體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用。 A. 腫瘤平均體積±SEM，B. 小鼠平均體重±SEM。結(jié)果證明：B-hGITR小鼠是評(píng)估人GITR抗體體內(nèi)藥效的有力工具。
參考文獻(xiàn)
Wang B, Zhang W,Jankovic V，et al. Combination cancer immunotherapy targeting PD-1 and GITR can rescue CD8+ Tcell dysfunction and maintain memory phenotype. Sci Immunol. 2018 Nov 2;3(29). pii: eaat7061.
