植物脯氨酸檢測(cè)試劑盒(茚三酮比色法)說(shuō)明書(shū)

植物脯氨酸檢測(cè)試劑盒(茚三酮比色法)
Plant Proline Assay Kit with Ninhydrin
● 產(chǎn)品組成：

組分貨號(hào)	名稱	規(guī)格	貯存
PP5040-01	試劑1-Pro裂解液	100 ml	RT
PP5040-02	試劑2-Pro標(biāo)準(zhǔn)液	1 ml	4℃
PP5040-03	試劑3-Pro顯色液	50 ml	RT 避光

●     產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
脯氨酸(Proline，Pro)是一種環(huán)狀的α-亞氨基酸，呈中性，等電點(diǎn)為6.30，易溶于水。在正常環(huán)境情況下脯氨酸含量較低，但在逆境下(旱、熱、冷、凍、鹽堿等)，脯氨酸常有明顯積累，即積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)。植物脯氨酸檢測(cè)試劑盒(茚三酮比色法)檢測(cè)原理是脯氨酸與茚三酮共熱發(fā)生反應(yīng)，能產(chǎn)生穩(wěn)定的紅色產(chǎn)物，以分光光度計(jì)測(cè)定處吸光度，在一定范圍內(nèi)顏色深淺(即吸光度)與脯氨酸濃度成正比。
該試劑盒不使用傳統(tǒng)的磺基水楊酸和甲苯等有害溶劑，經(jīng)濟(jì)環(huán)保。
該試劑盒主要用于測(cè)定植物組織中的游離脯氨酸含量，不適用于動(dòng)物及醫(yī)療樣品中脯氨酸的測(cè)定。
按照一次使用1 ml Pro顯色液計(jì)算，試劑盒可以使用50次。
● 自備材料：
植物根莖、葉子等；剪刀；螺蓋離心管或鎖蓋離心管或96孔板；1ml玻璃比色皿；分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀；水浴鍋或干浴器；離心機(jī)
● 操作步驟：
1、 樣本處理：
取新鮮植物組織，清洗干凈，擦干，剪碎，迅速稱取， 按照20mg重量加入1ml Pro裂解液的比例加入Pro裂解液（建議使用1.5ml螺口離心管或鎖蓋離心管），沸水浴或干浴處理20分鐘 (期間間歇混勻)，10000rpm離心 2分鐘，上清即為脯氨酸提取液，4℃保存?zhèn)溆谩４郎y(cè)提取液如不能及時(shí)測(cè)定，應(yīng)置于-20℃保存，1-2天內(nèi)穩(wěn)定。
2、 Pro顯色液的配制：
把小管裝的茚三酮粉末，全部加入到茚三酮溶解液中，劇烈混勻至完全溶解，即配成Pro顯色液。注意：Pro顯色液具有一定腐蝕性，請(qǐng)小心操作。
3、 配制系列脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：
取1ml 試劑1-Pro裂解液全部加入到裝有Pro標(biāo)準(zhǔn)液的小管中，混勻后徹底溶解，即配成的Pro標(biāo)準(zhǔn)液（100mg/ml）。
取1 μl 100mg/ml 標(biāo)準(zhǔn)液加入到1ml Pro裂解液中，即配成100μg/ml Pro標(biāo)準(zhǔn)液待用。參照下表配制1-6號(hào)不同濃度的Pro標(biāo)準(zhǔn)溶液。

編號(hào)	1	2	3	4	5	6	7	8
100μg/ml Pro標(biāo)準(zhǔn)液加入量（ml）	0.01	0.02	0.04	0.06	0.08	0.10	0.15	0.2
Pro裂解液（ml）	0.49	0.48	0.46	0.44	0.42	0.4	0.35	0.3
脯氨酸含量（μg）	1	2	4	6	8	10	15	20

4、 樣品測(cè)定:
= 1 \* GB3 ① 分光光度計(jì)測(cè)定：參考下表設(shè)置反應(yīng)混合液，依次加入試劑：

	空白管	標(biāo)準(zhǔn)管	測(cè)定管
試劑1-Pro裂解液	0.5 ml	-	-
步驟1中的脯氨酸提取液	-	-	0.5 ml
Pro標(biāo)準(zhǔn)液（步驟3中1-8管）	-	0.5 ml	-
試劑3-Pro顯色液	1 ml	1 ml	1 ml

= 2 \* GB3 ② 酶標(biāo)儀測(cè)定：參考下表設(shè)置反應(yīng)混合液，依次加入試劑：

	空白管	標(biāo)準(zhǔn)管	測(cè)定管
試劑1-Pro裂解液	50 μl	-	-
步驟1中的脯氨酸提取液	-	-	50 μl
Pro標(biāo)準(zhǔn)液（步驟3中1-8管）	-	50 μl	-
試劑3-Pro顯色液	100 μl	100 μl	100 μl

③ 水浴煮沸或干浴20分鐘，間歇混勻。加熱時(shí)務(wù)必注意避免液體暴沸濺出，可使用鎖蓋離心管或螺旋蓋離心管。
④ 冰浴或流水冷卻至室溫，10000 rpm離心 2分鐘，如發(fā)現(xiàn)沒(méi)有不溶物，也可以不離心。 
⑤ 取上清，用空白管作為對(duì)照，用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀檢測(cè)分別測(cè)定反應(yīng)混合液520nm吸光度值。 
5、 計(jì)算：
以系列脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)(1-6號(hào)管)含量(μg)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)定管的吸光度進(jìn)而計(jì)算其脯氨酸含量。

植物組織樣品脯氨酸含量(μg/g)=（C×V_T）/(W×V_S)
C=從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的脯氨酸含量(μg)
V_T=步驟1中脯氨酸提取液總體積(ml)
W=步驟1中使用的樣品鮮重(g)
V_S=步驟4中測(cè)定時(shí)加入的脯氨酸提取液體積(ml)