Hoxb5：細胞的命運我做主! -----將B細胞重編程為功能性T淋巴細胞

小編：天地悠悠過客匆匆潮起又潮落~~~

小鼠甲：咳咳，咱們是個嚴肅的科普節(jié)目……

小編：天地洪荒，宇宙萬物，生命起源，又到了萬物~~~

小鼠乙：（咆哮體）現(xiàn)在是冬天！冬天！咱們幾（今）天要講的是細胞！細胞！

小編：呃(⊙o⊙)… 好吧，咱們今天要講的是細胞(*^▽^*)，大家都知道細胞在發(fā)育過程中其命運是被嚴格控制的，以確保每個細胞能以和諧的方式發(fā)揮它的生理功能。一些重要的細胞因子參與其中，好像上帝的指令一樣，決定了不同細胞的命運，很多科學家也在孜孜不倦的探索其中的奧秘。今天就為大家?guī)�來一個關于B細胞重新編程為T細胞的精彩故事^_^且聽我慢慢講來[1] ……

目前已經(jīng)有很多研究證明通過特定轉(zhuǎn)錄因子的表達可以將多能或多能細胞導向分化成特定類型的細胞或從一個譜系轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪粋�譜系。比如Gata1的表達將單核細胞前體轉(zhuǎn)化為紅系-巨核細胞和嗜酸性粒細胞[2-4] ，Cebpα將B細胞轉(zhuǎn)化為巨噬細胞[5]; 刪除Pax5將B細胞轉(zhuǎn)化為未定型的造血祖細胞[6,7]; Gata3的表達將T淋巴細胞轉(zhuǎn)化為肥大細胞[8]; Cebp±和Spi1的表達將T淋巴細胞轉(zhuǎn)化為巨噬細胞和樹突狀細胞[9]，Bcl11b的缺失將T淋巴細胞轉(zhuǎn)化為自然殺傷樣細胞[10]。但是嘗試通過沉默B細胞關鍵的轉(zhuǎn)錄因子，將B轉(zhuǎn)換為T細胞只取得了有限的成功，因為無法在功能上重建整個T細胞譜系，并且在某些情況下，這種操作會增加癌化的風險[6,7,11,12]。但通過以往這些研究，總的來說造血細胞的命運是可以通過基因操作來改變的。

但是到底是哪些轉(zhuǎn)錄因子重點參與了細胞間的轉(zhuǎn)化呢？

15個轉(zhuǎn)錄因子的異常表達與B細胞重編程為T細胞相關

為了找到這些關鍵的轉(zhuǎn)錄因子，研究人員首先采用RNA-Seq鑒定了成熟完全定型的譜系細胞與Hematopoietic stem cells（HSC）和multipotent progenitors（MPP）中差異表達的轉(zhuǎn)錄因子。如果基因在HSC和MPP中的相對表達量比在譜系細胞中高2倍(P< 0.05)，則被指定為在HSC和MPP中差異表達的基因。研究人員篩選出15個在造血干祖細胞高表達的轉(zhuǎn)錄因子，它們在HSC和MPP中表達，但未在譜系定型的細胞中表達[圖1] ，研究人員推斷這些因子在Pro-pre-B細胞中過表達有可能改變該細胞類型的命運。

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候選基因初步篩選出來了！我們?nèi)绾悟炞C這一推斷呢？

科學家們將15種轉(zhuǎn)錄因子中的每一種克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體中，調(diào)整成相同的感染滴度后，混合感染純化過的Pro-pre-B細胞[圖2a]，使感染的Pro-pre-B細胞表達GFP熒光蛋白（TFs），以感染表達GFP空載體的Pro-pre-B細胞為對照（Ctr）[圖2b] ，然后移植到清髓預處理的野生型受體小鼠[圖2d]。移植后四周，發(fā)現(xiàn)部分受體鼠胸腺中出現(xiàn)GFP標記的T淋巴細胞[圖2c]。對GFP+胸腺細胞的流式細胞分析顯示存在CD44+CD25-CD4-CD8- DN1、CD44+CD25+ DN2、CD44-CD25+ DN3和CD44-CD25- DN4的雙陰性胸腺細胞（DN），CD4+CD8+雙陽性胸腺細胞（DP），CD4+CD8-單陽性T淋巴細胞和CD8+CD4-單陽性T淋巴細胞（SP）[圖2e]。

說明這候選的15種轉(zhuǎn)錄因子中，存在具有調(diào)控B細胞向T細胞轉(zhuǎn)化作用的轉(zhuǎn)錄因子�？墒沁@15種候選轉(zhuǎn)錄因子中的哪一種誘導B至T細胞轉(zhuǎn)化呢？

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Hoxb5的過表達將B細胞重編程為T細胞

為了找到15種候選轉(zhuǎn)錄因子中的哪一種誘導B至T細胞轉(zhuǎn)化，研究人員進一步縮小篩選范圍。將上述實驗中得到得到GFP+胸腺細胞進行單細胞PCR測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些胸腺細胞大致可以分為這三類病毒來源：1.表達Hoxb5的逆轉(zhuǎn)錄病毒（retro-Hoxb5）；2.表達14轉(zhuǎn)錄因子但缺乏Hoxb5（14-TF）；3. 只表達GFP的對照的病毒。結(jié)果顯示，在所有retro-Hoxb5-pro-pre-B細胞受體小鼠（以下稱retro-Hoxb5小鼠）中，超過65％的胸腺有核細胞是Ter119-Mac1-CD19-GFP+，而在14-TF或pro-pre-B細胞轉(zhuǎn)移的小鼠中未檢測到[圖3a]。在移植后4周和8周時，能夠在retro-Hoxb5小鼠外周血（PB），脾和淋巴結(jié)（LN）中檢測到GFP+CD4+和GFP+CD8+成熟T細胞，隨后在PB中12周降低和消失[圖3b]。GFP+ T細胞包括TCRβ+和TCRγδ+細胞。

此外，研究者從15-TF小鼠中分選GFP+胸腺細胞進行單細胞測序,結(jié)果證明上述細胞在單細胞水平同時含有B細胞BCR的Ig重鏈V(D)J和T細胞TCRβ的V(D)J重組現(xiàn)象 [數(shù)據(jù)未展示] 。

這些數(shù)據(jù)表明，Hoxb5有可能是調(diào)控B細胞向T細胞轉(zhuǎn)化過程中起關鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子。那么我們?nèi)绾芜M一步確定這樣的結(jié)果呢？而且在上述的實驗中，Hoxb5的組成型表達是否有影響到T、B細胞的發(fā)育呢？

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為了排除這些影響，并驗證上述實驗結(jié)果�？蒲腥藛T構(gòu)建了一個關鍵的工具小鼠：Hoxb5LSL/+[圖4a]。利用這個小鼠與特異性的Cre小鼠交配，得到兩種組織特異性表達Hoxb5（并同時表達EGFP）的小鼠：1. Vav-Cre,Hoxb5LSL/+，造血細胞中特異性表達Hoxb5簡稱Vav-Hoxb5-GFP小鼠；2.CD19-Cre, Hoxb5LSL/+ ,B細胞中特異性表達Hoxb5簡稱CD19-Hoxb5-GFP小鼠。首先對這兩種小鼠進行基本的流式分析檢測，結(jié)果顯示：1. CD19-Hoxb5-GFP小鼠顯示出與來自同窩對照Hoxb5LSL/+相當?shù)陌l(fā)育模式[圖4b、c] ；2.與Hoxb5LSL+對照小鼠相比Vav-Hoxb5-GFP小鼠中所有造血細胞，包括T淋巴細胞，小鼠的骨髓和胸腺中的ETP（early T cell progenitors）比例相當 [圖4f] 。胸腺中的DN和DP細胞[圖4d] ，以及PB，脾，LN和BM中的CD4+和CD8+ T淋巴細胞的比例也相當 [圖4e]。

這說明Hoxb5的組成型表達對B、T細胞發(fā)育影響都較小。

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B細胞特異性表達Hoxb5可以將B細胞重編程為T細胞

對CD19-Hoxb5-GFP小鼠進行分析發(fā)現(xiàn)，外周血中約90％的CD19+ B淋巴細胞表達GFP-Hoxb5，而PB中的CD3+ T淋巴細胞或Mac1+骨髓細胞不表達GFP[圖5a]。然而在小鼠4w、8w、12w的胸腺中卻能檢測到GFP+ T淋巴細胞 [圖5b] 。

在將CD19-Hoxb5-GFP小鼠BM分離的pro-pre-B細胞移植到經(jīng)輻照預處理的野生型同品系受體小鼠中。移植后4周胸腺中>30％的T淋巴細胞為GFP+[圖5c]，脾臟中>10％的T淋巴細胞[圖5d]和LN中的>7％[圖5e]是GFP+。 這些結(jié)果表明Hoxb5特異性表達將B重編程為T細胞。

仿佛聽到Hoxb5在說：你現(xiàn)在雖然是B淋巴細胞，但是只要同時表達了我Hoxb5，不久后你就會變成T細胞哦！厲不厲害？

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Hoxb5誘導的T細胞在功能上等同于野生型T細胞

好了，我們已經(jīng)確定了Hoxb5確實在B細胞向T細胞轉(zhuǎn)化的過程中起關鍵的作用，那么我們得到再生的T細胞是否是有功能的呢？帶著這一問題，我們看看科研人員又做了哪些工作？

為了評估成熟再生的T細胞（iT）的功能，研究者將retro-Hoxb5 pro-pre-B細胞移植到經(jīng)過亞致死輻射的（3.5Gy）Rag1-/-（C57BL/6背景，缺乏B細胞和T細胞）受體小鼠中。3周后能夠在Hoxb5-Rag1-/-小鼠PB中檢測到GFP+ iT淋巴細胞[圖6a]。將Hoxb5-Rag1-/-小鼠中GFP+脾細胞分離后，體外用CD3和CD28抗體培養(yǎng)6天，檢測到各細胞因子比例與野生型比較無差異[圖6b、c]。進一步異體皮膚移植模型證明，利用iT細胞重建的Rag1-/-小鼠，能夠排斥異體皮膚移植物（BALB/c 背景）。比如在移植部位形成的凸起，潰瘍和壞死病變 [圖6d] ，免疫熒光實驗結(jié)果顯示同種異體移植皮膚的真皮層能夠檢測到GFP+CD3+ iT淋巴細胞浸潤[圖6e]。

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iT細胞的功能是否包含獲得免疫記憶功能呢？研究人員在異種皮膚移植時隔8周后，對初次皮膚排斥反應的小鼠進行了二次異體皮膚移植。結(jié)果表明iT細胞產(chǎn)生了免疫記憶功能，能夠在更短地時間內(nèi)發(fā)生免疫應答，排斥二次移植的異體皮膚組織[圖7a] 。流式分析排斥的皮膚組織制備的單細胞群發(fā)現(xiàn)排斥部位存在浸潤激活的CD44higCD69+的CD4+ SP和CD8 SP+ T細胞[圖7b] ，并且含有能夠分泌INFγ和IL-17的CD4+ SP，以及能夠分泌INFγ 的CD8+ SP T細胞[圖7c] 。因此，上述重編程再生的T細胞具備獲得性免疫記憶功能。

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B細胞重編程為T細胞過程中Hoxb5是瞬時表達的

當~當~當……

重點又來啦�。� Hoxb5確實指導了B細胞向T細胞重編程，并且再生的T細胞也具有功能。​那么再生的T細胞是否依然需要Hoxb5的表達維持其生理功能呢？

為了研究這一機制，研究人員又構(gòu)建了條件性誘導表達的Hoxb5小鼠模型(Tet-on Hoxb5-BFP) [圖8a]，此小鼠在用DOX誘導下能夠表達Hoxb5，停止飼喂DOX則關閉Hoxb5表達。在Tet-Hoxb5小鼠飲用水中添加DOX一周后，在小鼠BM中能檢測到BFP+ pro-pre-B細胞[圖8c] 。之后將BM BFP+ pro-pre-B細胞轉(zhuǎn)移到輻照過的NOD-SCID小鼠中（以下稱為Tet-Hoxb5-NOD-SCID小鼠）并持續(xù)飼喂DOX飲水。轉(zhuǎn)移后4,8和12周時檢測受體鼠在PB，LN，脾和胸腺都含有供體細胞來源的T細胞[圖8d、e]，在轉(zhuǎn)移后4周時檢測到超過95％的供體來源的T細胞是BFP-[圖8f]。如果Tet-Hoxb5-NOD-SCID小鼠連續(xù)喂DOX藥水兩周后停止喂藥[圖8b]，則4周后檢測發(fā)現(xiàn)PB和脾中的所有T淋巴細胞都是BFP- [圖8e] 。進一步分析發(fā)現(xiàn)BFP+細胞表達Hoxb5，而BFP-細胞與野生型一樣不表達Hoxb5 [圖8g] 。

這些結(jié)果證明體內(nèi)2周的Hoxb5表達就可以成功地將B細胞重編程為T細胞，之后不再需要Hoxb5持續(xù)性表達來維持T淋巴細胞在胸腺的進一步發(fā)育成熟。單細胞測序分析表明上述重編程來源的T細胞都含有免疫球蛋白重鏈VDJ重排序列，證明起源于B細胞[數(shù)據(jù)不再展示]。

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重編程的機制研究：Hoxb5將B細胞轉(zhuǎn)化為ETP

那么，B細胞重編程為T細胞過程中Hoxb5是從哪開始起作用的呢？

研究人員進一步探索重編程中否將pro-pre-B細胞直接重編程為ETP（iETP， early T cell progenitors ）。他們分析了retro-Hoxb5小鼠中BM和胸腺中Lin-CD44+c-kithiCD25- iETP [圖9a]的細胞學動態(tài)學。結(jié)果顯示，在移植后第2周至第6周，在retro-Hoxb5小鼠的BM中檢測到GFP+iETP [圖9b] ，移植后約3周達到最大豐度。 BM-ETP在轉(zhuǎn)錄組學水平顯示還殘留Pro-pre-B細胞的部分基因表達特征[圖9c] 。在胸腺中移植后第4周檢測到最大豐度[圖9b]，轉(zhuǎn)錄組水平顯示已經(jīng)完全關閉Pro-pre-B特異表達基因（如Pax5, EBF1, CD19） [圖9c] 。

為了驗證胸腺中iETP能夠分化為成熟T細胞，研究人員分離了iETP，進行了胸腺內(nèi)二次移植實驗。結(jié)果顯示ETP可以在受體鼠胸腺發(fā)育成熟為CD4+ SP和CD8+ SP T細胞，并且成功分布到脾臟，淋巴結(jié)和外周血[圖9d] 。因此，Hoxb5是在骨髓中將B細胞重編程為 T淋巴祖細胞（重編程中間態(tài)細胞），之后在胸腺中完成重編程，產(chǎn)生有功能的T淋巴祖細胞，再發(fā)育產(chǎn)生成熟T細胞。

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Hoxb5靶向B、T細胞調(diào)節(jié)因子和染色質(zhì)修飾因子

最后，研究人員還通過RNA-Seq和CHIP-Seq實驗對比分析了表達Hoxb5和表達GFP對照的Pro-pre-B細胞的轉(zhuǎn)錄組和表觀組學特征。Hoxb5在pro-pre-B細胞中的表達改變了許多與染色質(zhì)修飾相關的基因的表達，包括表觀遺傳修飾因子Hdac9，Ezh1，Ldb1，Cbx8和Asxl1 [圖10a]，與B到T細胞重編程過程基因表達模式的改變一致。重要的是，早期B細胞發(fā)育所必需的轉(zhuǎn)錄因子，如Ebf1，Bcl11a，F(xiàn)oxp1和Foxo1 被Hoxb5抑制，而對T細胞發(fā)育或功能至關重要的Nfatc1，Tcf12， Lmo2和Prdm1在pro-pre-B細胞中被Hoxb5激活[圖10b] 。

GSEA（Gene set enrichment analysis ）分析表明，與感染空載體相比，retro-Hoxb5 pro-pre-B細胞中對B細胞發(fā)育必需的Ikzf1（Ikaros）和Pax5被顯著抑制[圖10c、d]，而且遺傳修飾因子Kmt2a（Mll）（一種對HSC自我更新重要的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶）也被顯著抑制[圖10e] 。

這些結(jié)果表明，pro-pre-B細胞中Hoxb5的表達抑制B細胞譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子和特征基因的表達，增強與T細胞發(fā)育相關的轉(zhuǎn)錄因子和基因的表達，從而實現(xiàn)誘導B細胞到T細胞的命運轉(zhuǎn)化。

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好了，總之研究人員揭示了轉(zhuǎn)錄因子Hoxb5的表達能夠在體內(nèi)將Pro-pre-B細胞重編程為有生理功能的T細胞。Hoxb5通過抑制B細胞關鍵轉(zhuǎn)錄因子、激活T細胞相關轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)控表觀遺傳相關分子，從而實現(xiàn)B細胞到T細胞的命運改變。

這時候，仿佛又聽到Hoxb5在傲嬌的說：單單靠我一個轉(zhuǎn)錄因子，在B細胞中維持短短2周的表達，就可以抑制一堆B細胞特異的基因，促進一堆T細胞特異的基因，直接把B細胞變成了T細胞了，而且是記憶力很好的T細胞，有獲得性免疫記憶功能哦！我膩不膩害？ 

故事終于講完了~~~小編要喝口水~~~接著廣告時間到�。。�！

大家還記得故事里用到的很重要的工具小鼠嗎？ Hoxb5LSL/+ 小鼠（條件性過表達），Tet-on Hoxb5-BFP小鼠（誘導型條件性過表達），他們都是由百奧賽圖構(gòu)建的哦，如果您有基因編輯模式動物的需求歡迎聯(lián)系我們^_^

參考文獻

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