發(fā)展中的商品流式細(xì)胞儀

從二十世紀(jì)八十年代至今，世界上生產(chǎn)流式細(xì)胞儀的廠家?guī)捉?jīng)變遷，BC & BD仍在，新玩家不斷進(jìn)入，并購(gòu)重組各取所需，它們生產(chǎn)各種不同性能和功能的流式細(xì)胞儀�？傮w而言，呈現(xiàn)出以下的發(fā)展趨勢(shì)：

 

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1. 應(yīng)用對(duì)象從細(xì)胞到顆粒 

 

一般而言，流式細(xì)胞儀檢測(cè)的對(duì)象是細(xì)胞，而且是呈獨(dú)立狀態(tài)的懸浮于液體中的細(xì)胞，即單細(xì)胞懸液。組織和器官中的細(xì)胞，必須用各種方法制備成單細(xì)胞懸液，才能進(jìn)行檢測(cè)。

細(xì)菌、浮游生物等也可以用流式細(xì)胞儀分析。

一些不是細(xì)胞的單個(gè)粒子，如病毒、細(xì)胞核、染色體、原生質(zhì)體等也是流式細(xì)胞儀的檢測(cè)對(duì)象。實(shí)際上，用“顆粒”而不僅僅是“細(xì)胞”來(lái)定義流式細(xì)胞儀的檢測(cè)對(duì)象，顯然更有代表意義。

 

因?yàn)榱魇郊?xì)胞儀可以將“顆粒”視同為“細(xì)胞”來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，在特制的微球上包被抗原，抗體或核酸探針，以微球?yàn)檩d體來(lái)檢測(cè)各種可溶性蛋白、細(xì)胞因子、自身抗體、特定的核酸序列等，從而使流式細(xì)胞儀的檢測(cè)對(duì)象擴(kuò)展到分子范圍。

 

Luminex公司的多重流式檢測(cè)平臺(tái)能夠自一個(gè)微量反應(yīng)孔中同時(shí)檢測(cè)50、100甚至多達(dá)500種分析物，儼然成為這一技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)，官方網(wǎng)頁(yè)列出：https://www.luminexcorp.com/zh/partners/ 近100家合作伙伴。

 

國(guó)內(nèi)，唯公科技等制造商也在研發(fā)和生產(chǎn)基于編碼微球的流式多重檢測(cè)平臺(tái)。

 

唯公科技 EasyCell 流式與液相芯片兼用平臺(tái)

 

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2. 檢測(cè)顆粒尺度大大拓寬

 

常規(guī)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顆粒的范圍為0.5-50μm。

電荷分選流式細(xì)胞儀檢測(cè)顆粒范圍與噴嘴直徑等相關(guān)，最大應(yīng)到噴嘴直徑的1/3-1/2，目前最大直徑的噴嘴為200μm。

Union Biometrica公司的氣流分選平臺(tái)COPAS FP和BioSorter能夠適應(yīng)大到1500μm的顆粒，可以用于分選模式動(dòng)物的卵和幼蟲(chóng)；模式植物種子與花粉；大體積細(xì)胞與細(xì)胞簇等。CytoBuoy公司的Cytosense也可以到1500μm。

 

Union Biometrica公司氣流分選流式原理圖

 

通過(guò)光路優(yōu)化，采用多角度光散射，使用特殊熒光探針，甚至加裝紫色激光收集散射光信號(hào)，有些流式細(xì)胞儀可以實(shí)現(xiàn)0.2μm顆粒與噪音信號(hào)的鑒別。

 

Apogee著力于微顆粒分析，其A50-Micro plus散射光的檢測(cè)低限至80nm，可用于循環(huán)微粒，外泌體及特殊微生物檢測(cè)。

 

Apogee A50-Micro plus

 

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3.多種流路技術(shù)商品化

 

絕大多數(shù)流式細(xì)胞儀基于鞘液流體動(dòng)力學(xué)模式。

因?yàn)樨?fù)壓進(jìn)樣省去了龐大的壓縮氣源，可以靈活使用各種上樣管，已經(jīng)成為幾乎所有公司新儀器的選擇。

 

一般認(rèn)為，流式細(xì)胞儀采用毛細(xì)管而非鞘液，容易被大的細(xì)胞或聚集細(xì)胞所阻塞，而且流動(dòng)細(xì)胞難以準(zhǔn)確聚焦，流速難以維持恒定。

Guava平臺(tái)easyCyte（現(xiàn)被Luminex公司收購(gòu)）通過(guò)負(fù)壓進(jìn)樣，采用高壓注射泵與PEEK管路，建立自穩(wěn)流的微毛細(xì)管系統(tǒng)，據(jù)稱(chēng)解決了以上困擾，帶來(lái)的好處是無(wú)需鞘液，產(chǎn)生廢液也少。

 

Guava easyCyte（Luminex）

 

Thermo公司聲波流式細(xì)胞儀Attune NxT ，該產(chǎn)品利用超聲波將細(xì)胞聚集在樣品流中軸線(xiàn)上。進(jìn)樣速度至1mL/min時(shí)，也可以避免基于鞘液的流式的所謂軸流加寬和細(xì)胞分散現(xiàn)象，這一技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)是快速檢測(cè)，同時(shí)對(duì)稀有細(xì)胞的分析比較有利。

 

Thermo Attune NxT

 

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4. 從相對(duì)計(jì)數(shù)到直接絕對(duì)計(jì)數(shù)

 

為滿(mǎn)足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，流式細(xì)胞儀必須采集一定數(shù)量的細(xì)胞，儀器設(shè)定以細(xì)胞數(shù)為停止條件。傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀測(cè)試結(jié)果為相對(duì)計(jì)數(shù)，即目標(biāo)細(xì)胞在某一總體系中的比值。

隨著應(yīng)用深入，人們發(fā)現(xiàn)比值的變或者不變，以及變化大小不能反映細(xì)胞的真實(shí)變化，絕對(duì)計(jì)數(shù)，即單位體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)被證明更具實(shí)際價(jià)值。

最早是采用雙平臺(tái)法來(lái)解決以上問(wèn)題，即用血細(xì)胞分析儀來(lái)獲得白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等濃度，再結(jié)合流式細(xì)胞儀測(cè)定的百分比來(lái)計(jì)算被測(cè)細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)值。由于該法需要使用兩種儀器，操作步驟多、變異系數(shù)大，不同實(shí)驗(yàn)室之間的差異也較大，因此應(yīng)用受到限制。

后來(lái)人們采用微球法，即用已知濃度的微球作為參比，通過(guò)被測(cè)細(xì)胞和微球的比例關(guān)系來(lái)進(jìn)行絕對(duì)計(jì)數(shù)，但因計(jì)數(shù)微球價(jià)格較為昂貴，實(shí)際應(yīng)用受到限制。

 

近年來(lái)，廠家的共識(shí)回到了測(cè)定進(jìn)樣體積這一思路上來(lái)，替代微球法直接進(jìn)行絕對(duì)計(jì)數(shù)，取得更為精確的結(jié)果。區(qū)別在于不同產(chǎn)品具體測(cè)定技術(shù)的差別。

蠕動(dòng)泵：Accuri C6 Plus、CytoFlex

注射泵：easyCyte、NovoCyte、CytoFlow

流量傳感器：FACSVerse、Bricyte E6

 

Sysmex CytoFlow系列TVAC體積測(cè)定原理

 

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5. 光路優(yōu)化和光學(xué)新元件的應(yīng)用

 

龐大的水冷或氣冷的激光器逐漸被小型化的固態(tài)激光器取代。

光纖傳導(dǎo)應(yīng)用越來(lái)越普遍。

光纖耦合讓光能量傳輸更高效，而不為公司所專(zhuān)有。

雪崩光電二極管等等新檢測(cè)器提供新的選擇。請(qǐng)見(jiàn)專(zhuān)家分析：

流式細(xì)胞儀是怎么“看見(jiàn)”光的？

以及光學(xué)元件的神級(jí)組合讓靈敏度達(dá)到新的高度。

 

MESF是儀器靈敏度衡量的標(biāo)準(zhǔn)，基于微球，基于鞘液。

不同公司沒(méi)有約定俗成，不是那么容易比較，但就同一公司產(chǎn)品而言：

BD FACSCelesta FITC 25 PE 15

Beckman Coulter CytoFlex  FITC 30    PE 10 

 

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6.以多色分析為核心的新型光學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展

 

早期流式細(xì)胞儀的主要應(yīng)用還是細(xì)胞DNA含量測(cè)定，這一技術(shù)對(duì)設(shè)備要求不高，通常配備一個(gè)散射光和一個(gè)熒光信號(hào)的流式細(xì)胞儀就足以應(yīng)付。隨著新型熒光探針的不斷開(kāi)發(fā)和儀器軟、硬件的逐步更新，流式細(xì)胞儀多色熒光分析得到了迅速發(fā)展，包括兩個(gè)方面：

單激光多色，如488nm激光同時(shí)激發(fā)7色，紫色激光同時(shí)激發(fā)10色……

多激光：如10激光機(jī)器。

也包括兩種新的光學(xué)設(shè)計(jì)機(jī)型：

光譜流式，利用特殊的接受裝置收集某范圍內(nèi)的全發(fā)射光譜，無(wú)需補(bǔ)償，區(qū)別發(fā)射光譜重合度高的熒光染料對(duì)。目前有Sony公司SP6800Z和SA3800，Cytek公司的Aurora。

質(zhì)譜流式，利用質(zhì)譜原理對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)檢測(cè)的流式技術(shù)。這個(gè)名為CyTOF的平臺(tái)最初由DVS Sciences公司開(kāi)發(fā)，后被Fluidigm公司收購(gòu)。儀器采用同位素標(biāo)記抗體來(lái)標(biāo)記或識(shí)別細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號(hào)分子，并根據(jù)流式細(xì)胞原理分離單個(gè)細(xì)胞，再用感應(yīng)耦合等離子質(zhì)譜（ICP-MS）觀察單個(gè)細(xì)胞的原子質(zhì)量譜，最后將原子質(zhì)量譜的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號(hào)分子數(shù)據(jù)。2015年推出的Helios的檢測(cè)通道達(dá)到135個(gè)，幾乎沒(méi)有信號(hào)重疊或背景噪音。

來(lái)自CyTek網(wǎng)站，不代表本人觀念

 

必須注意的是，多色分析提供了多種細(xì)胞特性的相互關(guān)系圖，從而更加精確地界定一種細(xì)胞亞群，更好地對(duì)不同細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)。但是，同時(shí)檢測(cè)的熒光染料越多，需準(zhǔn)確調(diào)節(jié)各通道之間的補(bǔ)償，技術(shù)難度更大，因?yàn)槠渲邪�含的信息量非常大，錯(cuò)誤信號(hào)摻雜的概率也相應(yīng)增加，所以數(shù)據(jù)分析時(shí)需格外注意，一般需采用不同的標(biāo)記方案多次相互驗(yàn)證才能得出重要結(jié)論。光譜流式和質(zhì)譜流式的出現(xiàn)克服了補(bǔ)償問(wèn)題。

但是，熒光染料匹配仍未解決，畢竟不是每個(gè)激光器都能如設(shè)計(jì)所愿，同時(shí)激發(fā)6色，7色到10色，甚至如光譜流式所希望的16色或者32色。所以，對(duì)20色以上多色分析儀器來(lái)說(shuō)，標(biāo)稱(chēng)往往都是理論，至少在目前還是設(shè)計(jì)師的想象。

 

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7.數(shù)據(jù)處理能力不斷提升

 

 

隨著數(shù)字化技術(shù)的引入，以及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的升級(jí)，流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)處理能力得到極大提升。

數(shù)據(jù)處理速度：反映數(shù)據(jù)掃描頻率，用Hz表示。

處理精度：信號(hào)采集精度，用比特表示，反映采集通道多少。目前儀器一般在20比特（2的20次方，100萬(wàn)通道）以上，最高達(dá)32比特（43億通道）。

線(xiàn)性范圍：目前一般在10⁵以上，最高到10⁷。

單文件存儲(chǔ)能力：反映文件儲(chǔ)存能力，對(duì)稀有細(xì)胞分析有利。

 

數(shù)據(jù)能力的提升直接影響到儀器的分析和分選速度。

速度的提升是光路，流路和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)三者共同優(yōu)化改善的結(jié)果。

傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀，分析速度不超過(guò)10000 events/s，新上市產(chǎn)品基本達(dá)到25000 events/s（注意：不是細(xì)胞/s）以上，如Beckman Coulter公司CytoFlex為30000 events/s，Cytek公司Aurora 為35000 events/s ，BD公司的LSRFortessa 為40000 events/s with beads，Bio-Rad公司ZE5為100000 events/s。

 

Bio-Rad ZE5

 

BD公司FACSCalibur的機(jī)械分選，速度只有300/秒，對(duì)少量細(xì)胞收集困難，須配用濃縮系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞回收；捕獲管的移動(dòng)和濃縮系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷大，影響分選目的細(xì)胞功能特性；由于捕捉器移動(dòng)不可避免地影響到流路穩(wěn)定，造成不確定性；機(jī)械裝置較難徹底清洗消毒。機(jī)械式分選已被速度更高的電荷分選所完全取代。

如BD公司FACSAria III（70 psi /90 kHz）和InFlux（60 psi /100 kHz） 四路分選，純度>98%，得率>80%, 分選速度25000 events/s，繼續(xù)提高分選速度，純度不受影響，得率會(huì)按Poisson分布下降。

Beckman Coulter公司的MoFlo XDP和MoFlo Astrios EQ，據(jù)稱(chēng)有效分選速度達(dá)到70000細(xì)胞/s。

 

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8.  儀器不斷小型化到微流控

 

追求小型化，幾乎是所有流式制造商開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品的共識(shí)。

看一組數(shù)字：主機(jī)W x D x H

BD  Accuri C6 plus / FACSVia    37.5 x 41.9 x 27.9  cm

BD  FACSVerse / FACSlyric         63.2 x 57.9 x 57.9  cm

BD FACSCelesta                          58    x   61 x  59    cm

Beckman Coulter CytoFlex       42.5  x 42.5 x 34    cm

Miltenyi Biotec  MACSQuant   60     x 35    x 40    cm

Thermo Attune NxT                  58     x 43    x 40    cm

Cytek Aurora                             54     x 52    x 52    cm

Mindray BriCyte E6                   50     x 55    x 50    cm

                              （簡(jiǎn)直有種腰圍大于70不敢出門(mén)的趕腳）

 

“小”意味著節(jié)省空間，容易安裝和轉(zhuǎn)移，“小”更值得期許的是減少樣本體積，降低試劑消耗，提高檢測(cè)速度，以及縮小空間所帶來(lái)的光電及液路的改善。

 

微流控技術(shù)興起于上世紀(jì)90年代，顧名思義就是使用微通道（尺寸為數(shù)十到數(shù)百微米）處理或操縱微小流體。

On-chip公司于2012年推出了世界上第一臺(tái)微流控芯片流式On-Chip Sort，以低壓對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選，降低對(duì)細(xì)胞的損傷；簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作；容易實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的無(wú)菌；使用一次性交換型模塊，減少樣品間交叉污染；無(wú)需清洗流路通道。Miltenyi Biotec公司的MACSQuant Tyro、Namocell公司的Namocell等亦先后推出類(lèi)似的微流控流式分選產(chǎn)品。

 

on-chip公司之on-chip sort

 

Sony公司分選平臺(tái)的兩大核心技術(shù)即為所謂的CoreFinder全自動(dòng)校準(zhǔn)技術(shù)和可更換式微流體芯片的液路設(shè)計(jì)。最新型號(hào)MA900，全自動(dòng)光路及液流校準(zhǔn)；立體式雙光斑四激光激發(fā)，最多同時(shí)檢測(cè)12色熒光；四路分選。

 

Sony MA900

 

專(zhuān)門(mén)生產(chǎn)分析型微流控流式的制造商Handyem公司，針對(duì)微流控裝置容易導(dǎo)致細(xì)胞黏附和堵塞的問(wèn)題，于2015年推出HPC-150（國(guó)內(nèi)品牌深圳芯凱瑞），采用雙高精度玻璃注射泵代替蠕動(dòng)泵或單注射泵，據(jù)稱(chēng)克服了上一代產(chǎn)品易見(jiàn)的流路堵塞沉積等問(wèn)題。

 

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9.融合顯微成像技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)

 

細(xì)胞生物學(xué)兩大技術(shù)平臺(tái)分別基于顯微鏡和流式，前者以形態(tài)分析為優(yōu)，可提供詳細(xì)的細(xì)胞圖像信息，但解釋主觀、費(fèi)時(shí)費(fèi)力；后者以統(tǒng)計(jì)學(xué)見(jiàn)長(zhǎng)，卻缺乏成像能力，因此無(wú)法了解亞細(xì)胞定位。

融合顯微成像技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)的圖像流式細(xì)胞儀，以Amnis平臺(tái)為代表（現(xiàn)被Luminex公司收購(gòu)），最新型號(hào)ImageStreamX Mark II，從細(xì)胞經(jīng)過(guò)流動(dòng)池開(kāi)始即按線(xiàn)性分拆進(jìn)行分線(xiàn)性照相，其冷CCD采用時(shí)間延遲積分方式進(jìn)行信號(hào)采集，每一個(gè)樣本的分析都生成該樣本中所有細(xì)胞的熒光強(qiáng)度測(cè)量參數(shù)和圖像數(shù)據(jù)庫(kù)，包括“每個(gè)細(xì)胞”的明場(chǎng)、暗場(chǎng)以及熒光圖像。

對(duì)于微弱熒光信號(hào)可以通過(guò)明視野細(xì)胞圖像輔助設(shè)定遮罩，特定加強(qiáng)遮罩下細(xì)胞熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)微弱熒光圖像的捕捉和分析。

系統(tǒng)可以對(duì)每個(gè)細(xì)胞分析超過(guò)500種量化參數(shù)，包括細(xì)胞整體的散射光和熒光信號(hào)強(qiáng)度，以及對(duì)細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞信號(hào)分布的分析。

圖像流式細(xì)胞儀無(wú)須為了得到細(xì)胞群統(tǒng)計(jì)學(xué)資料而損失豐富的形態(tài)信息，也無(wú)須為了獲得細(xì)胞細(xì)節(jié)而損失統(tǒng)計(jì)學(xué)功能。

 

Amnis圖像流式細(xì)胞儀ImageStreamX Mark II

 

Sysmex公司最近推出MI-1000，自動(dòng)檢測(cè)多達(dá)10000細(xì)胞的圖像熒光。

 

Union Biometrica公司的氣流分選平臺(tái)COPAS VISION也加入了明場(chǎng)圖像。

 

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10.專(zhuān)業(yè)化和臨床型儀器紛紛面世

 

CytoBuoy公司生產(chǎn)多種用于水體微型生物分析的流式細(xì)胞儀，如CytoBuoy安放在浮標(biāo)上；CytoSub具有特殊的耐壓裝置，以及內(nèi)部鞘液循環(huán)處理裝置，不需外部加入鞘液，可在水下200米使用。Bentley Instruments 公司和Delta Instruments 公司公司專(zhuān)門(mén)提供牛奶場(chǎng)使用的專(zhuān)項(xiàng)檢測(cè)儀器。

 

臨床市場(chǎng)是商品流式細(xì)胞儀最具潛力的發(fā)展方向。但是，診斷流式試劑的研發(fā)和報(bào)證，以及符合檢驗(yàn)流程的儀器開(kāi)發(fā)，與不斷增長(zhǎng)的臨床應(yīng)用需求并不匹配。

一些公司推出了專(zhuān)門(mén)的小型流式細(xì)胞儀，用于CD4細(xì)胞的快速計(jì)數(shù)，如FACSCount、CyFlow Counter等。

 

邁瑞公司面向臨床用戶(hù)工作流程和場(chǎng)景推出BriCyte E6，針對(duì)淋巴細(xì)胞亞群分群等臨床常規(guī)分析，可以實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)儀器常有的一鍵得結(jié)果，免去繁復(fù)的電壓和補(bǔ)償調(diào)整，其LIS的雙向通信，數(shù)據(jù)管理都非常符合臨床診斷的期望。類(lèi)似思路在后來(lái)上市的BD公司FACSlyric也有體現(xiàn)。

   BD FACSlyric 六色TBNK自動(dòng)分析和雙向LIS

 

老牌血球生產(chǎn)廠商Sysmex 在收購(gòu)Partec后的第五年，推出了PS-10流式樣本前處理系統(tǒng)，配合新款流式XF-1600，實(shí)現(xiàn)樣本處理、離心和檢測(cè)的全自動(dòng)化流程。詳情請(qǐng)見(jiàn)：

全自動(dòng)流式檢測(cè)時(shí)代的來(lái)臨！

可以期待，流式細(xì)胞儀未來(lái)將會(huì)作為一個(gè)重要的組成部分被整合到血液細(xì)胞分析流水線(xiàn)上，在這個(gè)系統(tǒng)中，血液細(xì)胞分析儀提供血常規(guī)結(jié)果和異常報(bào)警信息，流式細(xì)胞儀則根據(jù)這些信息對(duì)異常細(xì)胞進(jìn)行不同策略的精細(xì)鑒別。