B-hCD28免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠

隨著生物治療研究的深入和廣泛的應(yīng)用，單抗藥物一些獨(dú)特的不良反應(yīng)也被持續(xù)的關(guān)注。如一些藥物引起的肝臟毒性，有些則會(huì)引起全身性的免疫反應(yīng)輕則引起不適，重則會(huì)導(dǎo)致多器官的功能障礙綜合征，甚至造成死亡。

在探究抗體藥物毒性的過程中人源化小鼠成為一有力的工具。今天就為大家介紹一種CD28基因的人源化小鼠——B-hCD28小鼠。

CD28基因功能簡介

CD28( Cluster of Differentiation 28) 表達(dá)在T細(xì)胞上，是T細(xì)胞激活與存活的共刺激信號(hào)。CD28和TCR共激活的T細(xì)胞具有表達(dá)多個(gè)細(xì)胞因子的能力（尤其是IL-6）。CD28是唯一組成性表達(dá)在naïve T細(xì)胞上的B7家族受體（包括B7.1（CD80）和B7.2（CD86））。TCR和MHC：抗原復(fù)合體結(jié)合后，倘若沒有CD28:B7共刺激信號(hào)，T細(xì)胞是無活力的（anergic）。成熟的T細(xì)胞表達(dá)CTLA-4，和CD28競爭性結(jié)合B7，抑制T細(xì)胞過度激活。CD28激動(dòng)劑可激活T細(xì)胞，促進(jìn)免疫反應(yīng)，目前CD28抗體的應(yīng)用研究在臨床II期^{[1] [2]}。

1、CD28抗體的故事：

2006年轟動(dòng)一時(shí)的TGN1412（CD28抗體）臨床實(shí)驗(yàn)，是一起災(zāi)難性的藥物安全性事件。當(dāng)年，英國一家藥物臨床實(shí)驗(yàn)公司為德國TeGenero公司研制的CD28抗體進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)，用于治療自身免疫病和白血病。在給8名健康受試者(兩名為安慰劑對照)應(yīng)用藥物僅數(shù)小時(shí)后，6名志愿者出現(xiàn)了細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS ），受試者出現(xiàn)不同程度的肺、腎衰竭和凝血機(jī)制障礙。雖然經(jīng)過及時(shí)搶救6名志愿者挽回了生命，但也將承受免疫系統(tǒng)損壞的終身痛苦^[3]。

英國藥監(jiān)機(jī)構(gòu)對此事故做了調(diào)查，但并未發(fā)現(xiàn)TGN1412（CD28抗體）在制備和使用環(huán)節(jié)出現(xiàn)任何失誤，臨床前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示此藥是安全的。但以給猴子安全劑量的1/500注射到人體后，卻引起了嚴(yán)重的細(xì)胞因子風(fēng)暴。在此事件后，各藥物研發(fā)團(tuán)隊(duì)和藥品使用監(jiān)管機(jī)構(gòu)對單抗的使用都更為謹(jǐn)慎。

2、原因分析：

科學(xué)家們也對這一事故的原因進(jìn)行深入的研究分析。造成這一毒性反應(yīng)主要原因是CD4⁺ T細(xì)胞短期集中釋放大量的細(xì)胞因子，其中包括：腫瘤壞死因子（TNF），干擾素（IFN）和白細(xì)胞介素（IL）等。而TGN1412（CD28抗體）可以刺激CD4⁺ CD45RO⁺ 釋放細(xì)胞因子。但臨床前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)卻沒有反應(yīng)出此藥物潛在的毒性問題。此原因可能是由于用于實(shí)驗(yàn)的小鼠周齡較小且生長環(huán)境干凈，使得它組織駐留的CD4效應(yīng)記憶細(xì)胞（CD4EM）是比較缺乏的，CD28抗體引起的反應(yīng)很容易被Treg細(xì)胞所抑制。即便科學(xué)家在將CD28抗體應(yīng)用于小鼠之前立即去除Treg細(xì)胞，大量的循環(huán)TNF，IL-2和IL-6變得可檢測，但小鼠并沒有表現(xiàn)出明顯的反應(yīng)^[4]。而在猴子體內(nèi)雖然有CD4⁺ T細(xì)胞，但CD28的表達(dá)確是缺乏的, 故沒有受到TGN1412抗體激動(dòng)^[5]。在人體內(nèi)，雖然劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)劑量，但能夠已觸發(fā)大量的細(xì)胞因子釋放導(dǎo)致強(qiáng)烈的毒性反應(yīng)。

3、故事結(jié)局：

經(jīng)過科學(xué)家的不懈努力，在深入研究了CD28抗體各種機(jī)制以及造成毒性反應(yīng)的原因，吸取歷史的教訓(xùn)后，科學(xué)家對CD28抗體藥物重新進(jìn)行測試并采取的更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)念A(yù)防措施。使得CD28抗體又重新回到了藥物研發(fā)科學(xué)家的視野中。其給藥劑量為體重0.1ug/kg，低于2006年臨床實(shí)驗(yàn)給藥劑量的1000倍^[3]。

4、我們能做什么？

科學(xué)在不斷的進(jìn)步發(fā)展，新的技術(shù)也層出不窮。百奧賽圖在致力于打造基因編輯模式動(dòng)物的的一站式新藥研發(fā)服務(wù)平臺(tái)，助力全球藥企開發(fā)創(chuàng)新藥物的宗旨下，開發(fā)了一系列用于評(píng)價(jià)抗體藥物的小鼠模型，其中之一就有針對CD28抗體藥物研發(fā)的CD28人源化小鼠（B-hCD28）。

基本信息

蛋白表達(dá)分析

B-hCD28人源化小鼠脾細(xì)胞活化及流式檢測

結(jié)果顯示：在C57BL/6小鼠活化T細(xì)胞里，可檢測到mCD28⁺細(xì)胞。在B-hCD28純合鼠活化T細(xì)胞里，可檢測到hCD28⁺細(xì)胞。

B-hCD28模型驗(yàn)證

    ——免疫后小鼠抗體效價(jià)比較

利用hPDL1-his重組蛋白與CFA乳化后免疫C57BL/6和B-hCD28小鼠。14天后檢測免疫后小鼠血清中IgG1，IgG2a， IgG2b各亞型特異性抗體效價(jià)。檢測結(jié)果無顯著差異，說明hCD28小鼠B7－1/CD28共刺激信號(hào)途徑正常，嵌合CD28分子具有正常生物學(xué)活性。

參考資料

1. https://en.wikipedia.org/wiki/CD28

2. J Immunol. 2016 September 15; 197(6): 2045–2050. doi:10.4049/jimmunol.1601135.

3. FEBS J. 2016 Sep;283(18):3325-34. doi: 10.1111/ febs. 13754. Epub 2016 Jun 6. 

4. PLoS One. 2009;4(2):e4643. doi: 10.1371/journal. pone.0004643. Epub 2009 Feb 27. 4, e4643.

5. J Immunol. 2010 Apr 15;184(8):4185-95. doi: 10.4049/jimmunol.0903420. Epub 2010 Mar 15.

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