使用層粘連蛋白的非包被法對人hPSC進行有效的貼壁培養(yǎng)
2016年京都大學Miyazaki團隊發(fā)現(xiàn)在人hPSC傳代培養(yǎng)期間，可以向細胞懸浮液中添加層粘連蛋白iMatrix-511，這樣可以省略在培養(yǎng)皿上預包被的過程。在此之前，都公認必須要花費數(shù)小時對培養(yǎng)皿進行預包被以增強細胞附著性。另外，使用非包被法添加iMatrix-511，能減少這種細胞外基質的使用量，但功效卻與對培養(yǎng)皿采取預包被法時相同。最后，該團隊還證實了iMatrix-511的添加還能支持hPSC單細胞傳代的長期維持。通過使用非包被的iMatrix-511，hPSC的擴增可以變得更加有效，成本更低且更省時省力。
實驗方法
將hPSC鋪在含有10μM Y-27632和培養(yǎng)基質的培養(yǎng)基中。對于使用iMatrix-511非包被法的一般培養(yǎng)，iMatrix-511的濃度為0.25μg/cm2。例如，在無任何包被的6孔板的單孔中，加入含5μL 0.5mg/mL iMatrix-511母液的2mL細胞懸浮液，以進行細胞培養(yǎng)。接種后，以TeSR-E8和StemFit AK03培養(yǎng)基培養(yǎng)hESC H9細胞系和hiPSC（人體誘導多能干細胞）253G1細胞系。每4天用0.5×胰酶和5mM EDTA/DPBS組成的細胞消化液在室溫下處理細胞5min來進行傳代。培養(yǎng)基的體積為200μL/cm2。
在非包被法下生長的hPSC的特征
實驗團隊通過一系列方法評估了在非包被法下長期培養(yǎng)的hPSC是否正常。使用iMatrix-511的非包被法，hPSC能連續(xù)傳代，并傳代超過10次。與預包被法下培養(yǎng)的細胞類似，在非包被法下培養(yǎng)的hPSC增殖良好并保持正常的細胞形態(tài)。此外，它們能高度表達代表性的未分化細胞表面標志物SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60和Tra-1-81，并且不表達SSEA-1，表明了其持續(xù)的未分化狀態(tài)與以常規(guī)的預包被法下生長的細胞相似（圖1a）。團隊對非包被法生長的hPSC進行了qPCR分析，也證明了hPSC處于未分化狀態(tài)。與預包被法相比，兩者的未分化標記基因的表達水平很相似（圖1b），表明了非包被法和預包被法中生長的hPSC的未分化狀態(tài)幾乎沒有差異。核型分析顯示，非包被法不影響hPSC的穩(wěn)定性（圖1c，補充圖3）。這些結果表明即使在連續(xù)傳代培養(yǎng)后，非包被法也能維持hPSC的未分化狀態(tài)。最后，團隊評估了在非包被法中生長的hPSC分化成不同細胞系的潛力。hPSC可正常形成胚狀體。通過與誘導前的基因表達進行比較，胚狀體對于三胚層特異的標記基因的表達會高度上升，表明它們保持著分化潛力（圖1d）。因此，團隊得出結論，在非包被法下生長的hPSC能維持其多能性，并且非包被法可以應用于hPSC日常的連續(xù)傳代培養(yǎng)。
圖1. 在非包被法下生長的hPSC的特征。（a）具代表性的未分化標記物的流式細胞分析。途中灰色陰影區(qū)域為陰性對照。（b）未分化標記基因的qPCR分析。圖中顯示了非包被法下生長的經29次傳代的hPSC與在預包被法下生長的經10次傳代的hPSC的相對表達。（c）G帶正常核型分析。hESC H9細胞系具有正常的核型（46，XX）。（d）用于胚狀體分化的標記基因的qPCR分析。hPSC在非包被法下培養(yǎng)，然后用14天將其誘導成胚狀體。通過分析TaqMan hPSC Scorecard 序列檢測的單組數(shù)據，將具代表性的分化標記基因的表達與胚狀體形成前該基因的表達進行比較，結果表示如圖所列的基因組的表達有著超過兩倍的增長。數(shù)據是從在非包被法下生長了10代的hPSC中收集的。
結論
iMatrix-511在作為培養(yǎng)基補充劑，添加時能有效地支持細胞粘附，但它可以不通過預包被法來實現(xiàn)。與其他的基質蛋白不同，與預包被法相比，非包被法中iMatrix-511以低得多的濃度來支持細胞粘附和長期擴增。這種使用iMatrix-511的新方法可以降低hPSC維持的成本和時間。
參考文獻：
Miyazaki, Takamichi , et al. "Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner." Scientific Reports 7(2017):41165.
實驗方法
將hPSC鋪在含有10μM Y-27632和培養(yǎng)基質的培養(yǎng)基中。對于使用iMatrix-511非包被法的一般培養(yǎng)，iMatrix-511的濃度為0.25μg/cm2。例如，在無任何包被的6孔板的單孔中，加入含5μL 0.5mg/mL iMatrix-511母液的2mL細胞懸浮液，以進行細胞培養(yǎng)。接種后，以TeSR-E8和StemFit AK03培養(yǎng)基培養(yǎng)hESC H9細胞系和hiPSC（人體誘導多能干細胞）253G1細胞系。每4天用0.5×胰酶和5mM EDTA/DPBS組成的細胞消化液在室溫下處理細胞5min來進行傳代。培養(yǎng)基的體積為200μL/cm2。
在非包被法下生長的hPSC的特征
實驗團隊通過一系列方法評估了在非包被法下長期培養(yǎng)的hPSC是否正常。使用iMatrix-511的非包被法，hPSC能連續(xù)傳代，并傳代超過10次。與預包被法下培養(yǎng)的細胞類似，在非包被法下培養(yǎng)的hPSC增殖良好并保持正常的細胞形態(tài)。此外，它們能高度表達代表性的未分化細胞表面標志物SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60和Tra-1-81，并且不表達SSEA-1，表明了其持續(xù)的未分化狀態(tài)與以常規(guī)的預包被法下生長的細胞相似（圖1a）。團隊對非包被法生長的hPSC進行了qPCR分析，也證明了hPSC處于未分化狀態(tài)。與預包被法相比，兩者的未分化標記基因的表達水平很相似（圖1b），表明了非包被法和預包被法中生長的hPSC的未分化狀態(tài)幾乎沒有差異。核型分析顯示，非包被法不影響hPSC的穩(wěn)定性（圖1c，補充圖3）。這些結果表明即使在連續(xù)傳代培養(yǎng)后，非包被法也能維持hPSC的未分化狀態(tài)。最后，團隊評估了在非包被法中生長的hPSC分化成不同細胞系的潛力。hPSC可正常形成胚狀體。通過與誘導前的基因表達進行比較，胚狀體對于三胚層特異的標記基因的表達會高度上升，表明它們保持著分化潛力（圖1d）。因此，團隊得出結論，在非包被法下生長的hPSC能維持其多能性，并且非包被法可以應用于hPSC日常的連續(xù)傳代培養(yǎng)。
圖1. 在非包被法下生長的hPSC的特征。（a）具代表性的未分化標記物的流式細胞分析。途中灰色陰影區(qū)域為陰性對照。（b）未分化標記基因的qPCR分析。圖中顯示了非包被法下生長的經29次傳代的hPSC與在預包被法下生長的經10次傳代的hPSC的相對表達。（c）G帶正常核型分析。hESC H9細胞系具有正常的核型（46，XX）。（d）用于胚狀體分化的標記基因的qPCR分析。hPSC在非包被法下培養(yǎng)，然后用14天將其誘導成胚狀體。通過分析TaqMan hPSC Scorecard 序列檢測的單組數(shù)據，將具代表性的分化標記基因的表達與胚狀體形成前該基因的表達進行比較，結果表示如圖所列的基因組的表達有著超過兩倍的增長。數(shù)據是從在非包被法下生長了10代的hPSC中收集的。結論
iMatrix-511在作為培養(yǎng)基補充劑，添加時能有效地支持細胞粘附，但它可以不通過預包被法來實現(xiàn)。與其他的基質蛋白不同，與預包被法相比，非包被法中iMatrix-511以低得多的濃度來支持細胞粘附和長期擴增。這種使用iMatrix-511的新方法可以降低hPSC維持的成本和時間。
參考文獻：
Miyazaki, Takamichi , et al. "Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner." Scientific Reports 7(2017):41165.
