高分辨率熔解曲線(HRM)分析預(yù)混Mix(PCR)，能基因篩查嗎？
高分辨率熔解曲線(high-resolution melting，HRM)是一種基于單核苷酸熔解溫度不同而形成不同形態(tài)熔解曲線的基因分析新技術(shù)，具有極高的敏感性，可以檢測出單個堿基的差異。
作為一種高效穩(wěn)健的"post－PCR"技術(shù)，它不受突變堿基位置與類型的限制，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運行高分辨熔解即可完成對樣品的分析。HRM技術(shù)因操作簡便快捷、成本低廉、結(jié)果準確，并且實現(xiàn)了真正的閉管操作而受到普遍關(guān)注。
HRM原理：
在PCR反應(yīng)前將新型DNA飽和熒光染料加入反應(yīng)體系，然后將PCR產(chǎn)物直接導入高分辨熔解分析儀中，在一定的溫度范圍內(nèi)將PCR擴增產(chǎn)物進行加熱變性，儀器的光學檢測系統(tǒng)采集、分析熒光信號并繪制溫度熔解曲線，根據(jù)不同熔解曲線形狀來區(qū)分（單個）堿基差異。
最廣泛的 HRM 分析應(yīng)用領(lǐng)域是基因篩查�；蚝Y查是搜索 PCR 擴增片段中是否存在未知變異，它可在測序步驟之前進行或者作為替代測序方法。由于 PCR 產(chǎn)物突變可導致 DNA 熔解曲線的形狀改變，因此它可以利用 HRM分析檢測。雜交雙鏈 DNA 樣本擴增并熔解時，其熔解曲線不同于純合野生型或突變樣本。如果操作得當，可以減少至少95%的測序工作量。隨著DNA染料和分析儀器的發(fā)展，HRM技術(shù)還將繼續(xù)完善和改進，在遺傳病分子診斷領(lǐng)域發(fā)揮更多的作用。
HRM應(yīng)用：
| • 基因篩查 (突變研究) | • 雜合性研究 |
| • 突變分析 | • 物種鑒定 |
| • 單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 檢測 | • 甲基化分析 |
作為專注于PCR領(lǐng)域超過24年的高品質(zhì)試劑供應(yīng)商，Solis BioDyne為您推薦，5X熱啟動EvaGreen高分辨率熔解曲線分析-預(yù)混Mix（PCR）：
| 名稱 | 貨號 | 兼容的PCR儀器 |
| 5x HOT FIREPol EvaGreen HRM Mix (NO ROX) | 08-31-00001 | Bio-Rad: CFX96™ & CFX384™ Qiagen: Rotor-Gene® 6000 Eppendorf: Mastercycler®: ep realplex2 & ep realplex4 Illumina: The Eco™Roche: LightCycler® 480 |
* 不含參比染料ROX，如需要含ROX，請選擇：08-33-00001
5X熱啟動EvaGreen高分辨率熔解曲線分析-預(yù)混Mix（PCR）提供如下組分：
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極高的性價比（進口品質(zhì)，國產(chǎn)價格）：
| 品牌 | 貨號 | 規(guī)格 | 目錄價（元） | 單次反應(yīng)價格（元） |
| Solis BioDyne | 08-31-00001 | 1ml（250次） | 386 | 1.54 |
| Thermo | 4415452 | 5*5ml（2500次） | 18856 | 7.54 |
| Qiagen | 206546 | 25ml（2000次） | 21810 | 10.9 |
| DBI | DBI-2232 | 1000次 | 11000 | 11 |
| 天根（Tiangen） | FP210-02 | 500次 | 2480 | 4.96 |
| 宇恒生物（UE） | S2013 | 500次 | 2300 | 4.6 |
推薦的qPCR反應(yīng)體系配置：
| 組分 | 體積 | 終濃度 |
| 5x HOT FIREPol® EvaGreen® HRM Mix | 4 µl | 1x |
| 正向引物 (10 pmol/µl) | 0.16-0.5 µl | 80-250 nM |
| 反向引物 (10 pmol/µl) | 0.16-0.5 µl | 80-250 nM |
| DNA模板 | 可變 | 可變 |
| H2O（PCR級） | up to 20 µl | |
| Total | 20 µl |
* DNA模板濃度：cDNA 0.1 pg/μl -10 ng/μl ; gDNA 10 pg/μl – 4 ng/μl
推薦的qPCR反應(yīng)程序：
| 循環(huán)步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
| 起始激活（熱啟動） | 95ºC | 12 min | 1 |
| 變性 | 95ºC | 15 s | 40 |
| 退火 | 60º-65ºC | 20 s | |
| 延伸 | 72ºC | 20 s |
發(fā)表文章實驗結(jié)果展示：
【1】Negrisolo, Susanna et al. “Could the interaction between LMX1B and PAX2 influence the severity of renal symptoms?” European Journal of Human Genetics 26 (2018): 1708-1712.
使用Solis試劑盒，分析PAX2基因4號外顯子的錯義突變
【2】Gaczkowska, Agnieszka, et al. “Association of CDKAL1 Nucleotide Variants with the Risk of Non-Syndromic Cleft Lip with or without Cleft Palate.” Journal of Human Genetics, vol. 63, no. 4, 2018, pp. 397–406.
使用Solis試劑盒，分析CDKAL1基因SNP
HRM分析成功的關(guān)鍵：
1.保持較短的擴增片段，實現(xiàn)最高的靈敏度。與較大的擴增片段相比，100 bp 左右的擴增片段可簡化單核苷酸熔解曲線的檢測。
2.確保 PCR 擴增片段的特異性。錯配產(chǎn)物和引物二聚體可使數(shù)據(jù)解釋復雜化。引物濃度低于 200nM，MgCl2 在 1.5 mM至3 mM 范圍及使用熱啟動DNA 聚合酶將有助于獲得高特異性。
3.確保反應(yīng)使用足夠的模板。一般而言，Ct 應(yīng)低于30，以生成足夠的材料，實現(xiàn)準確的熔解分析。
除了上述的高效穩(wěn)健的HRM分析預(yù)混Mix產(chǎn)品，Solis BioDyne為客戶提供終點PCR（end-point PCR），qPCR（real-time PCR），反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcription），以及其它PCR所需的配套試劑。產(chǎn)品線縱覽圖如下：
Solis BioDyne來源于歐盟-愛沙尼亞共和國，專注PCR領(lǐng)域超過24年，Solis BioDyne一直致力于開發(fā)和生產(chǎn)高品質(zhì)的生命科學試劑，現(xiàn)已成為當今歐洲領(lǐng)先的試劑供應(yīng)商之一。高標準的生產(chǎn)標準和服務(wù)使Solis BioDyne成為全球值得信賴的首選PCR供應(yīng)商。我們的DNA聚合酶，PCR Master Mixes，qPCR Mixes和其它試劑被全球110多個國家的研究者所使用，包括頂級研究機構(gòu)和生物技術(shù)公司。
