HSP10,魚(yú)熱休克蛋白10ELISA試劑盒的檢測(cè)范圍及操作方法

HSP10,魚(yú)熱休克蛋白10ELISA試劑盒的檢測(cè)范圍及操作方法

•  檢測(cè)范圍：3.125 ng/ml – 100 ng/ml。
•  靈敏度：最低檢測(cè)濃度小于0.1 ng/ml。
•  特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類(lèi)似物交叉反應(yīng)。
•  重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% 。

操作步驟

1.   從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.   設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3.   樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL；空白孔不加。
4.   除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.   棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6.   每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.   每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

實(shí)驗(yàn)原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被魚(yú)10kDa熱休克蛋白1（HSP10）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的魚(yú)10kDa熱休克蛋白1（HSP10）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。
說(shuō)明
由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對(duì)所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。

• 最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)，請(qǐng)務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。
• 不同批次的同一產(chǎn)品可能會(huì)有少許差別，如：檢測(cè)限、靈敏度以及顯色時(shí)間等，請(qǐng)依據(jù)試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，網(wǎng)站電子版說(shuō)明書(shū)僅作參考。
• 只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測(cè)效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守本試劑盒的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明才會(huì)得到最佳的檢測(cè)結(jié)果。
• 本公司只對(duì)試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對(duì)因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請(qǐng)使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。
• 使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細(xì)胞提取液可能會(huì)由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。
• 若樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清，因該類(lèi)樣本干擾因素較多，如：細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、采樣時(shí)間等，所以可能存在檢測(cè)不出的情況。
• 某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因?yàn)榕c本產(chǎn)品所使用的檢測(cè)抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測(cè)出。

ELISA試劑盒常見(jiàn)問(wèn)題：
1.一個(gè)96T試劑盒能做多少個(gè)樣本?
 
每次實(shí)驗(yàn)需要做6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔和1個(gè)空白對(duì)照,所以最終可以檢測(cè)89個(gè)樣本,如果樣本做復(fù)孔,則等于樣本翻倍.
 
2.一次實(shí)驗(yàn)需要多少時(shí)間?
 
ELISA試劑盒大部分采用雙抗夾心法檢測(cè),預(yù)計(jì)時(shí)間是2-2.5小時(shí),競(jìng)爭(zhēng)法時(shí)間則為1.5-2小時(shí).
 
3.產(chǎn)品穩(wěn)定性如何?
 
經(jīng)測(cè)定，試劑盒在有效期內(nèi)按推薦溫度保存，其活性降低率小于5%。為減小外部因素對(duì)
試劑盒破壞前后檢測(cè)值的影響，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件需盡量保持一致，尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實(shí)驗(yàn)員來(lái)進(jìn)行操作可減少人為誤差。
 
4.樣本需要分批次檢測(cè),試劑盒是否可以只做一次標(biāo)準(zhǔn)曲線?
 
雖然試劑盒操作原理都一樣,但是每次實(shí)驗(yàn)的參數(shù)都會(huì)受到影響,比如時(shí)間,溫度等,所以為了得到更為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù),建議每次實(shí)驗(yàn)時(shí)重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.
 
5.樣本較多是否可以減少標(biāo)準(zhǔn)孔?
 
為了確保曲線的穩(wěn)定,不建議減少標(biāo)準(zhǔn)孔,請(qǐng)盡量確保6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔和1個(gè)空白對(duì)照.
 
6.試劑盒一次性用不完,下次還可以用嗎?
 
ELISA試劑盒的酶標(biāo)條可以拆卸,用不完的試劑按照說(shuō)明書(shū)要求的保存條件儲(chǔ)存起來(lái),在有效期內(nèi),可以下次在使用.
 
7.組織樣本經(jīng)過(guò)福爾馬林浸泡后,還能做ELISA實(shí)驗(yàn)嗎?
 
不可以,這類(lèi)樣本只能制作病理切片,可以做免疫組化或者WB等試驗(yàn)。
 
8.檢測(cè)一個(gè)指標(biāo),需要準(zhǔn)備多少血清?
 
我公司的ELISA試劑盒,要求檢測(cè)樣本是離心后50ul直接檢測(cè),所以客戶(hù)需要準(zhǔn)備離心后的血清在50-100ul之間,原則上就是確保50ul的上樣量,如果是多個(gè)指標(biāo),樣本以此類(lèi)推.
 
9.對(duì)于組織樣本需要提供多少呢?
 
組織樣本按照鮮重100mg以上即可,不可風(fēng)干或者滅菌等處理.
 
10.ELISA試劑盒檢測(cè)需要什么儀器?
 
全自動(dòng)酶標(biāo)儀,采用450nm波長(zhǎng),檢測(cè)OD值.
 
11.血漿樣本的時(shí)候可以選擇哪些抗凝劑？
 
通常選用的抗凝劑有EDTA、肝素、檸檬酸鈉.
 
12.保存一段時(shí)間的血清樣本發(fā)現(xiàn)變紅什么原因?
 
血清變紅色,通常是”溶血”現(xiàn)象導(dǎo)致的,其原因首先考慮血清是否收到污染,其次溶血是因?yàn)榧t細(xì)胞破碎,所以考慮在離心的時(shí)候不徹底,導(dǎo)致在保存過(guò)程中變紅的現(xiàn)象.此時(shí)的樣本若是淺紅色,建議再次離心到透明狀態(tài),如果是深紅色,不建議用于ELISA實(shí)驗(yàn).
 
13.之前用剩余的盒子是否可以跟新批次的試劑盒混用?
 
不建議混用,不同批次的試劑盒之間存在一定的皮內(nèi)差,混用會(huì)導(dǎo)致差異化增大,所以先把剩余的盒子用完,再做新批次.
 
14.不同試劑盒里面的洗滌液可以混用嗎?
 
洗滌液成分是一種弱酸,不同盒子里面的洗滌液都是一樣的,可以混用.
 
15.標(biāo)準(zhǔn)曲線做出來(lái)有一個(gè)點(diǎn)偏離曲線是什么原因?
 
曲線上面的某個(gè)點(diǎn)不在曲線上,這種現(xiàn)象叫做跳孔,通常是由系統(tǒng)誤差造成的,建議在試劑盒使用前充分平衡試劑盒,然后標(biāo)準(zhǔn)品要充分搖勻后,再做一次曲線.
 
 
16.你們公司試劑盒如何保證質(zhì)量?
 
① 高效、靈敏、特異性強(qiáng)的抗體。
 
② 吸附性能好、空白值低、孔底透明度高的固相載體。
 
③ 批內(nèi)差與批間差分別小于9%和11%，假陽(yáng)性率控制在3%；線性R值在0.99以上。