circRNA再發(fā)IF=18.88高分文章--circRNA機(jī)制研究匯總

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超強(qiáng)子調(diào)控circRNA-Nfix缺失誘導(dǎo)成年小鼠心肌梗死后再生
circRNAs正在成為心臟發(fā)育和疾病強(qiáng)有力的調(diào)節(jié)因子，但其在心臟再生中的作用仍然未知。鑒于此，作者與他的團(tuán)隊(duì)探究了與超增強(qiáng)子(SEs)相關(guān)的circRNA-Nfix在小鼠心肌梗死后再生過程中的功能，并探究了其調(diào)節(jié)心臟重塑的分子機(jī)制，并于2019年4月5日，將該成果發(fā)表在了circulation雜志（IF=18.88）中。在本研究中，作者首先利用生物信息學(xué)分析RNA測序數(shù)據(jù)并結(jié)合SE目錄，識別與SE相關(guān)的circRNAs，并利用qPCR和原位雜交技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)circNfix在人類、大鼠和小鼠的成年心臟中過表達(dá)。然后通過在心肌梗死(MI)后心肌細(xì)胞(CM)中干擾或過表達(dá)circNfix，探究其對細(xì)胞增殖和心肌修復(fù)過程中的作用，并發(fā)現(xiàn)下調(diào)circNfix能夠促進(jìn)心肌梗死后CM增殖和血管生成，并抑制CM凋亡，減輕心功能障礙，改善預(yù)后效果。最后作者利用染色質(zhì)免疫沉淀法(ChIP)和電泳遷移率轉(zhuǎn)移法(EMSAs)方法測定轉(zhuǎn)錄因子Meis1與能夠與circ-nfix的SE結(jié)合；利用RNA pull-down和熒光素酶報(bào)告基因分析方法研究circRNA與蛋白質(zhì)或與miRNA的相互作用；發(fā)現(xiàn)下調(diào)circNfix能夠增強(qiáng)Ybx1與Nedd4l (E3泛素連接酶)的相互作用，并誘導(dǎo)Ybx1發(fā)生泛素化降解，抑制下游cyclin-A2和cyclin-B1的表達(dá)。此外, circNfix還作為ceRNA，吸附mir-214并促進(jìn)Gsk3β表達(dá)和抑制β-catenin活性。即：SE調(diào)控的circNfix缺失通過抑制Ybx1泛素依賴降解，增加miR-214活性，促進(jìn)心肌梗死后心臟再生修復(fù)和功能恢復(fù)，可能是改善心肌梗死預(yù)后的一個(gè)有前景的策略。
技術(shù)路線

CircNfix是一種保守的心臟circrna。CircRNA的RPM表達(dá)水平（A）。CircNfi和circSlc8a1分別在P7小鼠和大鼠心肌細(xì)胞(CMs)和成纖維細(xì)胞(CFs)中的表達(dá)（B）。C-F.鑒定為環(huán)狀RNA。qPCR檢測 在鼠各種組織（G）、鼠心臟原代分析的各種細(xì)胞（H）、不同時(shí)間段的小鼠心臟組織（I）、不同時(shí)間段的小鼠心臟組織分離的心肌細(xì)胞（J）。ISH（K）和相應(yīng)的分析（L-M）檢測CircNfix在人、大鼠、小鼠心臟的表達(dá)。核質(zhì)分離PCR（N）和FISH（O）檢測CircNfix的亞細(xì)胞定位。

（1）CircNfix下調(diào)促進(jìn)了CM的增殖：Ki67免疫熒光（A）、EdU染色（B）、PH3免疫熒光（C）和Aurora B免疫熒光（D）檢測干擾CircNf對P7 CM的增殖能力的影響。熒光線粒體染料四甲基羅丹明乙酯(TMRE)檢測干擾CircNf對CM的分裂能力的影響（E）。Ki67免疫熒光（F）、EdU染色（G）和PH3免疫熒光（H）檢測過表達(dá)CircNf對P0 CM的增殖能力的影響。對Nkx2.5、α-SMA、RUNX1、DAB2進(jìn)行免疫熒光染色檢測P7 CM去分化能力（I）。流式細(xì)胞術(shù)分析干擾CircNf對CM的細(xì)胞周期的影響（J）。

（2）circNfix下調(diào)可誘導(dǎo)心肌梗死后心臟再生：心肌梗死前、梗死后1、14、28天超聲心動(dòng)圖分析心功能（A）。射血分?jǐn)?shù)的定量分析(EF)及縮短分?jǐn)?shù)(FS)（B-C）。小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染sh-circnfixo28天后的小鼠心臟得分（D）。心肌梗死后14、28天小鼠心室橫切面TTC染色（E）。心肌梗死后14天和28天Masson染色的心臟切片代表性圖像（F）。心臟切片中纖維化區(qū)域的定量分析（G）。心肌梗死后shcircNfix組Kaplan-Meier生存曲線分析（H）。

轉(zhuǎn)錄因子：
（1）轉(zhuǎn)錄因子Meis1通過結(jié)合Nfix位點(diǎn)的SE驅(qū)動(dòng)circNfix表達(dá)：H3k27ac、H3k4me1和H3k27me3在人心臟組織Nfix位點(diǎn)的ChIP-seq譜（云序生物提供該服務(wù)）（A）。H3k27ac、H3k4me1、H3k27me3、P300、DNA超敏(DHS)、Meis1及PhastCons在小鼠心臟組織Nfix位點(diǎn)的保守性評分，以及小鼠CMs中H3k27ac ChIP-seq（云序生物提供該服務(wù)）（B）。SE與circNfix啟動(dòng)子區(qū)looping事件的3C-qPCR分析（C）。四種成分增強(qiáng)子(E1、E2、E3、E4)構(gòu)建的pgl3啟動(dòng)子報(bào)告載體熒光素酶檢測（D）。Meis1沉默后P7 CMs中野生型E2和突變E2的熒光素酶活性（E）。circNfix-SE中孵育Meis1結(jié)合位點(diǎn)被DIG-ddUTP標(biāo)記寡核苷酸探針后，P7 CMs中提取的核蛋白的EMSA結(jié)果（F）。ChIP-qPCR（云序生物提供該服務(wù)）檢測顯示Meis1結(jié)合位點(diǎn)在circNfix-SE中擴(kuò)增（G）。QRT-PCR檢測Meis1基因敲除后P7 CMs中circNfix和Nfix mRNA的表達(dá)水平（H）。RNA FISH 檢測Meis1基因敲除后P7 CMs中circNfix的亞細(xì)胞定位（I）。EdU染色檢測Meis1和circNfix干擾后對P7 CMs增殖的影響（J）。

結(jié)合蛋白：
（2）CircNfix與Ybx1結(jié)合并促進(jìn)其降解：circNfix和對照組的蛋白質(zhì)譜分析（A）。采用Ybx1、Nedd4l或陰性IgG抗體進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)（云序生物提供該服務(wù)）（B）。P0 CMs中過表達(dá)circNfix后Ybx1蛋白表達(dá)水平（C-D）。qRT-PCR檢測P0 CMs中Ybx1 mRNA表達(dá)水平（E）。RNA FISH在P0 CMs中過表達(dá)和不表達(dá)circNfix時(shí)， circNfix和Ybx1的亞細(xì)胞共定位（F）。分餾實(shí)驗(yàn)表明，circNfix過表達(dá)促進(jìn)了Ybx1在細(xì)胞質(zhì)中的易位，增加了Ybx1在細(xì)胞質(zhì)中的降解（G）。在circNfix和Ybx1干擾后，細(xì)胞周期蛋白A2和細(xì)胞周期蛋白B1的表達(dá)水平（H）。ChIP-qPCR（云序生物提供該服務(wù)）檢測顯示，cyclin A2和cyclin B1啟動(dòng)子中Ybx1結(jié)合位點(diǎn)擴(kuò)增（I）。細(xì)胞裂解物用抗Ybx1抗體免疫沉淀，用泛素(Ub)特異性抗體、抗Ybx1抗體或抗nedd4l抗體免疫印跡分析進(jìn)行WB分析。過表達(dá)circNfix的CMs中Ybx1蛋白表達(dá)水平（K-L）。

ceRNA機(jī)制：
（3）circNfix與miR-214的相互作用：預(yù)測miR-214和miR-761能夠與circNfix結(jié)合（A）。成年小鼠心臟中下調(diào)circNfix后，miR-214和miR-761的表達(dá)（B）。雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測miR-214和circNfix能夠直接結(jié)合（C）。RNA pull-down（云序生物提供該服務(wù)）實(shí)驗(yàn)檢測circNfix能夠拉下miR-214（D）。RNA FISH實(shí)驗(yàn)檢測P0 CMs中，miR-124和circNfix能夠共定位在胞質(zhì)中（E）。RNA FISH實(shí)驗(yàn)檢測P0 CMs中，miR-124和Gsk3β能夠共定位在胞質(zhì)中（F）。雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測miR-214和Gsk3β 3’UTR直接結(jié)合（G）。WB檢測干擾circNfix后Gsk3β蛋白的表達(dá)水平（H）。WB檢測干擾或過表達(dá)miR-124后Gsk3β蛋白的表達(dá)水平（I）。WB檢測干擾circNfix和miR-214后Gsk3β蛋白的表達(dá)水平（J）。CMs中，干擾circNfix后β-catenin的表達(dá)水平（K）。CMs中，干擾Meis1后Meis1和 Gsk3β的表達(dá)水平（L）。CMs中，干擾Meis1和circNfix后GSK3β的表達(dá)水平（M）。干擾circNfix, Ybx1, miR-214 和 Gsk3β后，P7 CMs進(jìn)行pH3 和 Aurora B免疫染色（N）。

circNfix如何通過與Ybx1和miR-214結(jié)合來調(diào)控心臟再生過程：轉(zhuǎn)錄因子Meis1與circNfix的SE結(jié)合后，抑劑circNfix的表達(dá)，缺失的circNfix能夠增強(qiáng)Ybx1與Nedd4l (E3泛素連接酶)的相互作用，并誘導(dǎo)Ybx1發(fā)生泛素化降解，并進(jìn)一步抑制下游cyclin-A2和cyclin-B1的表達(dá)。同時(shí)，缺失的circNfix能夠，降低對miR-214的吸附，進(jìn)一步抑制Gsk3β及VEGF的表達(dá)，最終促進(jìn)心肌梗死后心臟再生修復(fù)和功能恢復(fù)。

全文鏈接：
https://www.ahajournals.org/doi/pdf/10.1161/CIRCULATIONAHA.118.038361

全轉(zhuǎn)錄組測序
環(huán)狀RNA測序
RNA pull down
RIP測序
ChIP測序
m6A RNA全轉(zhuǎn)錄組甲基化測序
m6A RNA 環(huán)狀RNA測序
m5C RNA全轉(zhuǎn)錄組甲基化測序
m5C RNA 環(huán)狀RNA測序
m1A RNA全轉(zhuǎn)錄組甲基化測序
m1A RNA 環(huán)狀RNA測序
超微量環(huán)狀RNA甲基化測序

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