ACE HILIC色譜柱方法開發(fā)指南Ⅰ - HILIC的優(yōu)劣勢剖析
親水作用色譜（HILIC）采用與反相液相色譜（RPLC）類似的洗脫液，為親水性或極性到（至）極性很強的分析物提供了適宜的保留和分離替代方法（適宜的保留和分離提供了替代方法）。
RPLC的特征在于保留較少或無保留，所以這類親水性分析物（log P 值約為零或更小的那類分析物）的保留是一種挑戰(zhàn)（這些親水性的分析物（log P 值約為零或更小的那類分析物）的保留對于RPLC是一個挑戰(zhàn)，因為用反相色譜方法這些分析物只具有很少的保留或者沒有保留）。
ACE HILIC色譜柱為親水性分析物提供了RPLC的替代選擇，無需使用諸如離子對試劑等添加劑。
多年來，比較常見的是采用高有機物含量的洗脫劑與水性組分結(jié)合使用（采用高有機含量的洗脫劑與水性組分結(jié)合是常見的HILIC方法），但HILIC一詞最早是在20世紀90年代[1]首次被提出用來代表極性分析物保留和分離所用的富含有機溶劑的洗脫劑（描述富含有機溶劑的洗脫劑用來保留和分離極性分析物）。
作為一種技術(shù)，HILIC已經(jīng)應(yīng)用到了幾乎所有的色譜應(yīng)用領(lǐng)域，并且經(jīng)證明可有效用于臨床分析、食品和飲料應(yīng)用、以及制藥行業(yè)和蛋白質(zhì)組學(xué)，這些領(lǐng)域中，極性到（至）極性很強的分析物的保留和分離仍然是一項挑戰(zhàn)。
色譜法所用HILIC的主要優(yōu)勢
HILIC可對極性到極性很強的分析物進行（提供）保留
作為一般的實用經(jīng)驗法則，如果RPLC模式下分析物在咖啡因之前洗脫（log P~零（約為0）），則可能更適合HILIC分離模式。
如果RPLC模式下分析物在咖啡因之后洗脫，則更適合RPLC。
圖1示出了（表示）一種含有草甘膦（log P = -2.39）、咖啡因（log P = -0.13）和阿米替林（log P = 4.90）的混合物的RPLC梯度色譜圖。
圖1的頂部顯示的是一個近似值，HILIC和RPLC模式可在log P尺度內(nèi)運行和重疊（顯示在Log P尺度下HILIC和RPLC模式操作和重疊的一個近似位置）。
很明顯，極性很強的分析物草甘膦會在RPLC模式下的柱頭塌陷附近洗脫，并且（表明）它非常適合HILIC。
RPLC模式可保留咖啡因（咖啡因可以使用RPLC模式），但也可使用HILIC。RPLC與HILIC之間的重疊區(qū)域常常會引發(fā)討論，因為兩種模式都具有優(yōu)勢：選擇通常都是由應(yīng)用導(dǎo)向（已有應(yīng)用決定）。
阿米替林是最適合RPLC的疏水性分析物（疏水性分析物最適合用RPLC）。
如果分析物的log P特性未知，運行在RPLC模式（如圖1所示）下的廣泛搜索梯度常�？梢詭椭_定近似分析物的（的分析物）親水性/疏水性，同時可指示最適合的分離模式。
圖1
HILIC和RPLC操作范圍和重疊的實際演示
色譜柱：ACE 2 C18, 100 x 3.0 mm
流動相：A = 10 mM 甲酸銨，pH 3.0 (aq) B = 10 mM 甲酸銨，pH 3.0 in MeCN:H2O (90:10 v/v)
梯度：5-100%B（10分鐘）
檢測：ELSD
流速：0.4 mL/min
溫度：30ºC
進樣：10 μL
使用VWR-Hitachi進行分析Chromaster（帶VWR ELSD90）
HILIC為RPLC提供了替代選擇
HILIC第二個優(yōu)勢特性在于：它通常能為RPLC提供互補或正交選擇，如圖2中所演示。
HILIC模式（圖2b）下，六種極性分析物的混合物的洗脫圖（洗脫情況）與采用RPLC分析的相同混合物正好相反，證明HILIC具有正交選擇性。
圖2
RP與HILIC之間的正交選擇性
（a）柱：ACE 5 C18, 150 x 4.6 mm
流動相：0.1%醋酸（溶于乙腈/水中）（5:95 v/v）
（b）柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流動相：0.1%醋酸（溶于乙腈/水中）（95:5 v/v）
流速：1 mL/min
溫度：22 °C
檢測：UV, 254 nm
進樣：5 μL
樣品：
1) 胞嘧啶
2) 次黃嘌呤
3) 胸腺嘧啶
4) 可可堿
5) 茶堿
6) 咖啡因
選擇性是色譜分析中分析物析出（分辨率）的關(guān)鍵，因此可利用HILIC最大化極性到極性很強的分析物的選擇性（對于極性到強極性化合物，可利用HILIC最大化選擇性）。
在方法開發(fā)過程中，利用選擇性是了解分析物保留行為的第一步，同時也是增加觀察到樣本（樣品）內(nèi)所有種類可能性的一種有效工具。
不同且復(fù)雜的HILIC多模式保留機制為RPLC提供了一種理想的互補選擇性分離模式。
HILIC使用高有機物含量的洗脫劑
第三個優(yōu)點源于HILIC模式下使用的高有機物含量的洗脫劑。
結(jié)果表明：與RPLC相比，其快速擴散系數(shù)可達RPLC的兩倍，從而可強化傳質(zhì)和減輕C項對范第姆特方程（減小范特姆第方程C相） [2]的作用。
但是，HILIC中的流動相必須包含至少3%的水性物質(zhì)，以（因需）在固定相粒子周圍形成吸附水層以便分散開（分配）。非質(zhì)子有機溶劑乙腈通常用作HILIC中較弱的溶劑。
此外，HILIC洗脫劑對MS檢測[3]也有幫助。
有機溶劑含量非常高，可實現(xiàn)理想的低表面張力（高的有機溶劑含量可提供一個理想的低表面張力），并為MS源提供高揮發(fā)性的液體流，從而改善去溶劑化和離子形成的條件，因此增強
了信號響應(yīng)。
HILIC分離通常可提供較低的背壓
通常，HILIC模式下的色譜柱（和體系（系統(tǒng)））背壓比水-有機的RPLC洗脫劑更低（尤其是當主要使用最常用的乙腈時）。
這為色譜工作人員提供了一個選擇：在流速更高、甚至多組色譜柱結(jié)合（串聯(lián)使用）的情況下，都可以使用更小、更高效的粒子，增加了平板計數(shù)（理論塔板數(shù)）或峰容量，同時背壓[4,5]也適度（在背壓合適的情況下，增加了平板計數(shù)（理論塔板數(shù)）或峰容量 [4,5]）。
色譜法所用HILIC的主要劣勢
HILIC法的穩(wěn)定性
這是一個經(jīng)常討論和報道的HILIC相關(guān)（與HILIC相關(guān)的）主題。
許多問題可以通過使用前足夠平衡的HILIC色譜柱的方式解決。
如果HILIC法包含一個梯度（梯度洗脫），那么進樣之間也需要足夠的平衡。
樣本溶解性
由于其本身的性質(zhì)，極性到極性很強的分析物很難溶解在有機物含量豐富的溶劑中并持續(xù)保持溶解狀態(tài)（在含有大量有機物的溶液中很難溶解以及保持溶解狀態(tài)）。
