高分辨熔解曲線法HRM實(shí)現(xiàn)基因分型

 
  基因分型在動(dòng)物、植物、微生物的物種、菌種篩查、篩選、缺陷、突變基因的檢測(cè)，根據(jù)個(gè)體基因類(lèi)型實(shí)現(xiàn)對(duì)諸如癌癥治療、監(jiān)測(cè)等的精準(zhǔn)用藥，以及消費(fèi)類(lèi)基因檢測(cè)如酒精代謝能力基因檢測(cè)等等領(lǐng)域有很多應(yīng)用。

  通常，基因分型SNP采用熒光探針終點(diǎn)法，檢測(cè)一個(gè)位點(diǎn)需要兩個(gè)熒光探針，如一個(gè)探針的熒光報(bào)告基團(tuán)用FAM通道，另一個(gè)用HEX(VIC)通道來(lái)檢測(cè)。由于合成PCR熒光探針的成本較高，為降低成本，可以采用較小的反應(yīng)體系，如在384孔熒光定量PCR儀上使用5uL的反應(yīng)體系。對(duì)于一些非臨床及消費(fèi)類(lèi)、或者需要檢測(cè)幾十個(gè)位點(diǎn)以上、對(duì)成本敏感的基因分型檢測(cè)應(yīng)用項(xiàng)目，可以考慮使用飽和染料的高分辨熔解曲線法HRM（High Resolution Melting Curve分辨率優(yōu)于0.1°C），如果不包括核酸提取的費(fèi)用，與探針?lè)ū�，成本可降�?0倍，甚至100倍。 HRM法為了能夠在熔化溫度Tm上區(qū)分出只差一個(gè)堿基的兩個(gè)DNA片段，在保證特異性的前提下，選擇被擴(kuò)增的DNA片段的長(zhǎng)度越短越好，因此，除了引物的設(shè)計(jì)有擴(kuò)增片段短的特殊要求外，對(duì)熒光定量PCR儀的HRM性能及擴(kuò)增的準(zhǔn)確性能則有很高的要求。以下幾點(diǎn)是保證HRM實(shí)現(xiàn)正確、可靠的基因分型的關(guān)鍵。

  首先，HRM的分辨率最好優(yōu)于0.05°C，一般，只有采用熒光成像技術(shù)的QPCR儀，因?yàn)橥瑫r(shí)采集所有樣品孔的信號(hào)才能勝任，而采用掃描技術(shù)的儀器完成一次全板掃描一般需要5秒以上，也就是說(shuō)第一個(gè)孔和最后一個(gè)孔的檢測(cè)時(shí)間差為5秒以上，熔化過(guò)程中溫度是連續(xù)變化的，這將導(dǎo)致每次檢測(cè)各孔上的溫度的不一致，因此，掃描式的QPCR儀一般不適合做HRM。

  第二，為了用只生成小于100bp擴(kuò)增產(chǎn)物的引物，有時(shí)可能無(wú)法很好地兼顧特異性，又由于HRM染料法本身特異性就較弱，這就給熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)帶來(lái)易發(fā)生非特異性的壓力，除了需要選用擴(kuò)增特異性好的QPCR Master Mix外，還需要先用梯度QPCR預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)優(yōu)化退火溫度，找到該引物的最佳退火溫度后，再使用Touchdown PCR 或稱(chēng)TD PCR來(lái)有效地控制非特異性擴(kuò)增。Stepdown PCR也能夠抑制非特異性擴(kuò)增，但抑制效果較Touchdown PCR弱一些。

  第三， 如果需要區(qū)分兩個(gè)純合子的Tm差較小時(shí)，例如當(dāng)兩個(gè)純合子的Tm差只有0.5°C時(shí)，它們對(duì)應(yīng)的雜合子就可能難以單純依靠Tm與兩個(gè)純合子區(qū)分開(kāi)來(lái)，這時(shí)，我們可以引入熔解曲線的Tm峰寬因子或峰的線型來(lái)判斷雜合子。

   圖一為在福生生物的FS384 QPCR儀上使用5uL反應(yīng)體系的FAM和VIC兩種探針的終點(diǎn)法檢測(cè)一個(gè)位點(diǎn)的384個(gè)樣品的SNP分型結(jié)果。

 
  圖二為在福生生物的FS384 QPCR儀上用Touchdown PCR方法來(lái)擴(kuò)增，接著用高分辨率0.02°C 的HRM實(shí)現(xiàn)低成本的基因分型，圖中左下角的表列出了所有樣品孔，根據(jù)Tm值及其峰寬值正確判斷出每個(gè)樣品的分型結(jié)果。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，兩個(gè)純合子的峰寬都小于1.5°C，而雜合子的峰寬在2°C左右。